全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1830-10 - 2010/01/07 (木) 01:59:11 - おお 加えますが私もそういうデーターはなんどか見たことがあります。

(無題) 削除/引用 No.1830-9 - 2010/01/06 (水) 17:25:37 - もりぞう 同じ経験が起こっているとのことで、少し安心？しました。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1830-8 - 2010/01/06 (水) 15:07:27 - 通りすがり 　似たようなことなら、時々あります。当方、臨床系で感染症の検査のために毎日大量のシークエンスを行っています。 　ABの解析ソフトであれば、波形とその上に青とか赤とか黄色でその塩基の信頼度が表示されるような画面ですよね。500塩基程度の配列を読むときでも、その配列が終わっていても、それ以降に波形は表示されていないのに、なぜか塩基配列が読み取れている場合があります。原因はリアクション時に断片がプライマーとしてどこかにくっついて、極々微量なのですが長い断片を作ってしまっているのでしょう。ABIの3000番台のシークエンサーははっきりいって高感度すぎなので、そういう結果が生まれると解釈しています。以前使っていた300番台ではそういうことは起こりませんでしたし。 　２，３塩基ずれて波形が重なっていたりしなければ、実験データとして必要な部分だけ使えばいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1830-7 - 2010/01/04 (月) 21:27:24 - ザンギ teminator labelのシステムだと見えないかもしれませんが、primer label のシステムでシーケンシングすると、鋳型の長さに相当する断片が大量に 出来てるのが泳動上の波形として見えます。 このDNA断片は末端がDideoxyではないので活きていて、伸長反応のプライマー に成りえます。 その末端がどこかにプライミングして長いDNA断片が生成してるんでしょう。 対象の配列に該当する部分がないか調べてみてはいかがでしょうか。 Fプライマーの時だけ問題の波形がでるのなら、PCRのRプライマーの５’末端 近傍の配列に類似の相補鎖がFプライマーからの伸長産物中にあるはずです。 この理屈が当てはまるなら、サイクルシーケンス反応がFプライマーだけで PCR反応になってしまうので、反応条件によっては問題になるかもしれません。 Rプライマーの５’末端にエクストラなミスマッチする配列をつければ解決 するかもしれません。ちょっと気持ち悪いけど。

(無題) 削除/引用 No.1830-6 - 2010/01/04 (月) 19:08:21 - もりぞう ピークは全くデータとして見えないので無視してもいいかもしれません。今のところ検出したい変異周辺には影響ないようですし。 が、なぜFor側だけそのような現象が起こるのかってのが腑に落ちないので、時間と試薬が許せる範囲で検討も続けたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1830-5 - 2009/12/29 (火) 10:21:09 - おお あ、ゲル精製はしているわけですね。 結局はポリメラーゼが何らかの理由でテンプレートを見つけて 伸長させているわけでしょうから、そういうのを抑えるしかありません。 まずPCRをできるだけ厳しい条件でおこないサイクル数もへらして、 できるだけアクシデンタルにできるプロダクトをへらすのがいいと思います。 単一バンドでもそこに期待していないものが全くないとはいい切れないので。 ゲル切出し(これはやってますね)。 シーケンス反応も厳し目にやった方がいいでしょうね。 でも現実波形データーが実際のシグナルと比べると、見れないほどの ノイズのように書かれてますので、それで邪魔になると考えられ ますか?

(無題) 削除/引用 No.1830-4 - 2009/12/28 (月) 19:12:34 - もりぞう そのPCR産物内の変異を調べています。ノイズが高くなると変異の検出に影響が出るのではないかということで、余分な配列についてもどうにかならないのかなと思っています。やる度に必要な部分の波形データに影響がないと言いきれないのが引っかかっているところです。 また、このデータを検査として使用したいので、慎重になっているところもあります。 時間と試薬の無駄にならないところで、結論を出したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1830-3 - 2009/12/28 (月) 18:35:55 - おお その余分な配列は必要ないので、見ないでいいというふうになりませんか? もしそうなら試薬と時間を無駄にしているような気がしますけど、 なにかそれとも事情があるのでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1830-2 - 2009/12/28 (月) 14:03:01 - おお それって何が問題なのですか? ノイズ程度の微量のシグナルを読んでいるわけで、意味がない という解釈ですよね。PCRかシーケンス反応の時に微量の副産物が できていると考えれば、若干改善できるかもしれないという方法は おのずと浮かんできますよね、必要があれば。

PCR産物のダイレクトシークエンスについて 削除/引用 No.1830-1 - 2009/12/28 (月) 13:54:07 - もりぞう 210bp程度のPCR産物のダイレクトシークエンスをしています。 PCR産物をカラム精製後、サイクルシークエンス反応はBigDye ver1.1を使用し、BigDye　XTerminatorで精製してシークエンス解析(ABI 3130xl)を行う、という手順です。 解析結果の塩基配列を見てみると、PCR産物の長さ約200bpの配列の後ろにPCR産物の配列がくっついています。そのくっついている配列の基になる波形データはまったく見えないのですが、解析ソフトは波形データがあって配列を出してきている、といった状況です。 シークエンス反応のプライマーを内側のものにしてみましたが、改善されません。 ゲル精製をした断片をテンプレートとしてシークエンスしたときも同じような現象が起こっているので、サイクルシークエンス反応に問題があるのかと思っていますが、プライマーを変える以外、どのような解決策があるのか、アドバイスをお願いします。

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---