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(無題) 削除/引用 No.1826-15 - 2009/12/28 (月) 15:17:36 - isso dscさま＞ それは初耳です。やってみようかと思います

(無題) 削除/引用 No.1826-14 - 2009/12/28 (月) 14:12:45 - dsc 以前かかっていたPCRがかからなくなったとき、反応液調整前にプライマーを95℃, 1min（→ on ice）したらかかるようになりました。以後、そのプライマー対を使うときには毎回加熱してから加えるようにしています。ぱっと見ではダイマーとかとりそうな配列ではないのですが。

(無題) 削除/引用 No.1826-13 - 2009/12/28 (月) 10:59:37 - isso あかねさん＞ はい、しております。 Rさん＞ 確かにバイサル直後は、かかりやすいような気がするのですが、それでも以前と比べるとかかりにくくなってしまいました

(無題) 削除/引用 No.1826-12 - 2009/12/28 (月) 10:54:30 - あかね 確認ですが、NcoI処理の後に、ゲノムDNAは一本鎖にしていますよね？ じゃないとbisulfiteの反応が起きないんで。

(無題) 削除/引用 No.1826-11 - 2009/12/28 (月) 10:36:55 - R バイサルファイト処理後のDNAは壊れやすいです。 もとのゲノムDNAからもう一度バイサルファイト処理したものを コントロールとしてみてはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1826-10 - 2009/12/28 (月) 09:00:07 - おお >[Re:9] ｓｓさんは書きました : > ありがとうございます。 > > ゲノムDNAとかきましたが、NCOでカットしたあと、バイサルファイト反応をしたゲノムです。 あ、メチレーション見るために反応させているのですね。 それなら、ちょっと経験がないのでわかりません。 反応後は中和とか精製してるんでしょうか、、、、 経験ある方のコメントが欲しいところです。

(無題) 削除/引用 No.1826-9 - 2009/12/27 (日) 18:16:48 - ｓｓ ありがとうございます。 ゲノムDNAとかきましたが、NCOでカットしたあと、バイサルファイト反応をしたゲノムです。 凍結・融解は確かに何度か繰り返していますが、以前は繰り返しても問題なかったです。濃度は測っておりません、 試薬も一応新しいものを使っていたのですが・・・・ もう一度考えてみます

(無題) 削除/引用 No.1826-8 - 2009/12/27 (日) 16:54:52 - おお 私も試薬がへたってるんだろうなぁっていう気がします。 ゲノムは精製の仕方にもよりますが、トランスジェニックの ジェノタイプの簡潔な方法だったらちょっと油断すると 壊れていくかもしれませんが、PK-フェノールをつかうような 方法とかキットでグアニジンなど使うようなやつだと、 まず大丈夫だと思います。

バッファーやプライマー、dNTPsを調整し直してみるのはどうですか 削除/引用 No.1826-7 - 2009/12/27 (日) 16:35:50 - れれれ Template DNAが原因である可能性もあるけど 反応バッファーやプライマー, dNTPsも凍結融解を繰り返していると、へたることがあります。 conc. stockから調整し直してみるのはどうですか？ genome DNAはTE bufferにとかして４度に保存しておくと、けっこうPCRくらいなら持ちそうな気がするんですがね。

(無題) 削除/引用 No.1826-6 - 2009/12/27 (日) 15:18:57 - やま 水に溶かしてたのなら壊れてる可能性大だと思います。 どれくらいの濃度にしていましたか？ 何回か溶かして凍らせてを繰り返しましたか？ （質問の時点で少なくとも２回はやってますよね） 濃いのでしたら取り直した物と一緒に泳動して見れば 壊れ具合がわかりやすいと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1826-5 - 2009/12/27 (日) 14:45:04 - ｓｓ おおさま＞ ポジコンとして、以前うまくいっていたtemplateもかけましたがだめでした。 やまさま＞ ゲノムDNAはー２０℃に水に溶解して保存しておりました。 amiさま＞ サイクラーは何台か試してみましたが、どれもうまくいきません。 皆様こんな経験あまりないでしょうか？あとは、試薬へのコンタミとかかなと

(無題) 削除/引用 No.1826-4 - 2009/12/27 (日) 14:26:49 - ami Thermal Cyclerが壊れたとか、、

(無題) 削除/引用 No.1826-3 - 2009/12/27 (日) 14:18:13 - やま ゲノムDNAが壊れちゃったんじゃないですか？ どうやって保存していましたか？ TE？4℃？とか　濃度は？

(無題) 削除/引用 No.1826-2 - 2009/12/27 (日) 13:53:14 - おお サンプルも一緒ですか? もしちゃんとかかった時のサンプルがあれば、同時にポジコンと してやってみるのがいいと思います。 私はサンプルのDNAを疑ってますけど、、、

PCRがかからなくなった！ 削除/引用 No.1826-1 - 2009/12/27 (日) 13:38:55 - ｓｓ ゲノムDNAのPCRなのですが、以前は、完全にPCRがかかっていたのですが（約500bpの産物）、この2カ月ほど、同じtemplateをもちいても、PCRがかからなくなりました。具体的には50bp−100bp付近にスメア状のバンドが激しくでるようになり。目的の産物が薄くしかでなくなりました。primer dimerかと・・・ まったっく同じ試薬を用いておこなっているのに、どうしてこのようなことが起きてしまうのでしょうか？まったく原因がわかりません。何かご意見いただけますでしょうか？

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