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TCEP還元剤 削除/引用 No.1818-7 - 2009/12/29 (火) 14:58:06 - ape wilcoさん たびたびのコメントありがとうございました。 発現誘導時間が3時間程度ですので、途中で追加するか 添加時間をずらして検討してみる必要がありそうですね。 あるいは対数増殖期が終わってから発現誘導と DTTの添加を行うか、でしょうか。 貴重なご意見を本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1818-6 - 2009/12/29 (火) 00:18:44 - wilco apeさんの目的では、かなりまじめにDTTを使用する必要がありそうですね。DTTは２MEよりは多少は長持ちしますが、当然ながら酸化されやすいので、培地には、フレッシュか、濃いのを作ってー20度で分注して保存して、たぶん、100uM-1mM程度の濃度で培養直前に加えたほうが良いように思います。キレート剤などはいらないでしょう。ただ大腸菌の場合はエアレーションするので、長く培養する場合は追加するか、培地を交換した方が良いかもしれません。

TCEP還元剤 削除/引用 No.1818-5 - 2009/12/28 (月) 12:39:12 - ape wilcoさん コメントありがとうございます。 ＞なるほど、それは２MEと同じです。 はDTTの不安定性が同等であるとの理解でよろしいでしょうか。 今回このような還元剤を培地に加えて大腸菌を培養するのは初めてなのですが DTTをどのように添加するのか（EDTAなどキレート剤は必要ないのか？）、また、添加後の作用時間など、論文には詳細に記載されていません。特に注意する点などありましたら、ご教授いただければ幸甚です。ご丁寧なコメントありがとうございました。勉強になりました。

(無題) 削除/引用 No.1818-4 - 2009/12/26 (土) 15:49:20 - wilco なるほど、それは２MEと同じです。唯一、DTTは2価で分子量が大きいので、膜透過性は２MEよりは若干遅いといわれています。ほ乳類細胞膜ではほとんど感じることはないですが。DTTの廃棄は培地と一緒にオートクレーブすればいいです。毒劇物指定ではないのでそのまま捨てられます。

TCEP還元剤 削除/引用 No.1818-3 - 2009/12/25 (金) 18:40:35 - ape wilcoさん ご意見ありがとうございます。 TCEPは膜を透過しないとのこと初耳で参考になりました。 実験自体は大腸菌に発現させたタンパク質のペリプラズムにおけるジスルフィド結合の阻害で、膜タンパク質との融合タンパク質として細胞外に表出させたいと考えています。 調べるとDTTは不安定であるとの記述が多く、誘導時間中に効果が持続するのかが疑問でしたので、TCEPを使用してみようと考えました。使用した論文が少ないのも膜透過性が無いからですかね。 いずれにせよ使用した後（TCEPを加えた培地）はオートクレーブしなければならないのですが、TCEP、DTTが混和された培地はオートクレーブできるのか、また廃棄はどのようにされているのかが疑問で質問させていただきました。ご存じの方がおられましたら是非ご教授下さい。

(無題) 削除/引用 No.1818-2 - 2009/12/25 (金) 14:23:29 - wilco 濃いのを作ってフィルター滅菌して後で加えればいいはずですが、これ、膜は透過しないんじゃなかったでしたっけ？２MEが毒物指定というのは、誰が決めたのか、意味のない規制ではやく撤廃されることを願ってますが、２MEでないといけない場合というのもそうないので、DTTを使えばいいですよ。

TCEP還元剤 削除/引用 No.1818-1 - 2009/12/24 (木) 21:47:09 - ape いつもお世話になっております。 還元剤として2-MEが毒物指定で使用できずトリス（２‐カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ塩酸塩）を実験に使用したいと考えています。 組換え大腸菌の培養に使用したいと考えているので使用後の滅菌処理が必要なのですが、この物質はオートクレーブ可能なのでしょうか。 ご使用になられている方がおられましたら、滅菌処置、廃棄方法をお教えいただけませんでしょうか。どうぞよろしくお願いいたします。

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