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ありがとうございます 削除/引用 No.181-8 - 2009/03/13 (金) 18:57:23 - challenger さまざまなご助言ありがとうございます。液化窒素は手に入るのですが、取り扱ったことがなく、なるべくなら避けて通れないものかと考えていたのです。ドライアイス／エタノールは全然問題ないので、それでやってみようと思います。

私はHanahan法で作ってました 削除/引用 No.181-7 - 2009/03/13 (金) 15:45:02 - ~ 液体窒素の入手が難しければ、 ドライアイスは入手できませんか？ ドライアイス/エタノールに放り込めば、ディープフリーザーとは比べ物にならない速さで凍結できます。 ケミケルのコンピタントセルとは比べられませんが、 ドライアイス/エタノールで10^9 cfu/ug DNAまで出せていました。 コンピタントセルの使用目的が、 １．ライブラリー作製用 ２．クローニング用 ３．サブクローニング用 によって、要求されるタイターが1桁は変わってきます。 もし、初めて作ったコンピタントセルの出来が悪くとも、 10^6 cfu/ug DNA位あれば、取っておいてサブクローニング用に使えるでしょう。

あった 削除/引用 No.181-6 - 2009/03/13 (金) 14:46:16 - カナマイシン http://www.obihiro.ac.jp/~tryp/ →実験マニュアル →コンピテントセル作製法（高効率） に言及されてます。 上記は塩化カルシウム法ではなくInoue-nojima法ですが、 どちらでも同じだったはず。 確かモレクロにも同じこと書いてあったはず。 手元にないのでうろ覚えです。 ちなみにInoue-nojimaはオススメですよ。 塩カルよりも劣る点は、作製時間がちょっとかかるってことくらいです。

(無題) 削除/引用 No.181-5 - 2009/03/13 (金) 14:38:59 - カナマイシン 「液体窒素またはドライアイスで急速凍結する作業を行わないと 　効率が○分の１に低下する」みたいな記述があったはずです。 数値と出典が曖昧ですが、やっぱり下がります。 他の行程が理想的にうまくいく保証があるならなら、 10分の１くらいの形質転換効率低下でとどまって、 （一般的な使い方なら）問題にならないと思いますが、 もし周囲に経験者がいなくて初めて作られるのであれば、 他のステップでもガンガン効率は落ちていくと思うので、 急速凍結処理はした方がいいんじゃない？と 私であればアドバイスします。 一般論として、やっぱり最初はプロトコールを遵守すべきでしょう。 取り急ぎの文章ですみません。

(無題) 削除/引用 No.181-4 - 2009/03/13 (金) 13:52:00 - あるば ドライアイスの上にアルミブロックを載せてチューブを並べ、 （こんなの：http://www.bio-bik.co.jp/campaign05.htm） アルミブロックとチューブを十分冷やしておいて そこに作ったコンピを1回分ずつ分注して-80度へ、というのはやります。 きっちり冷えており分注量が50μL位であれば、すぐに凍ります。 多少効率が落ちてもかまわないサブクローニングなんかに使います。 koda様が言われているように、初めてであればいくつか条件を振って 確認してみた方が良いとは思いますが、ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.181-3 - 2009/03/13 (金) 12:58:10 - koda 一般的には液体窒素のようですが、私の経験上、液体窒素を用いずに-80℃でもOKです。 有機化学系の研究室であってもその気になれば液体窒素くらいどうにかなりませんでしょうか。（他のラボから発泡スチロールに少量を分けてもらうとか） ・ディープフリーザー ・液体窒素 ・市販コンピ など、いくつか作製して、形質転換効率を測定してプロトコール確立をしてみてはどうでしょう。 「遺伝子組換え」実験になりますので法令、省令に従って行ってください。

コンピテントセル作製 削除/引用 No.181-1 - 2009/03/13 (金) 12:13:04 - challenger 　私の所属する研究室は有機化学のラボなのですが、現在、分子生物学を導入しようと考えています。そこで、まず、大腸菌の系（系というか、要するにベクター作製のためです）を立ち上げることになりました。現在、コンピテントセルの自作に取り組もうとしているところです。方法は塩化カルシウム法を用いる予定です。 　ネットでいくつかのプロトコールを検討したところ、いずれも最後に凍結保存する際に液化窒素を用いていますが、これは必須なのでしょうか？チューブを冷やしておいて、−８０度の冷凍庫にいきなりいれてはまずいのでしょうか？？

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