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やれるならどちら側でも切れるようにしてみたら良いと思う。 削除/引用 No.1801-6 - 2009/12/24 (木) 12:17:27 - れれれ 自分の経験では、Negative selectionをDTAでやったりFRTはつけなかったので、少し状況は違うかもしれないうえ、あくまで標的とする遺伝子の構造、ベクターのコンストラクトなどにかなり依存するとは思うのですが、 targeting vectorを1 cutしたときに、ベクターが５'側にくるときと、３’側にくるときの両方をES細胞に導入したときの、相同組み換え効率がちがった経験がありました。といっても自分の場合はたかだか２５０クローンくらいとって、とれた３つの組み換え体が同じ制限酵素で1 cutしたもの由来だったということですが。さらに自分の場合、最初のクローニングをPCRで行ったため、片側の相同領域が1kb程度だったことも関係しているかもしれないです。 ベクター上で制限酵素サイトをつけられて、サザンブロットでちゃんと検定できるのならば、両方試してみる価値はありそうです。 また、相同組み換え領域がどちらも結構長めですが、targeting vectorの取り扱いは大丈夫ですか？ものにもよりますが、15kbp以上のプラスミドを扱うのは時にやりづらいこともあります。（ライゲーションがうまくいかないとか、トランスフォーメンション後に大腸菌がプラスミドをこわすとかでプラスミドがうまくとれないとか）。 ESの組み換え体をとる仕事はけっこう力仕事で結果がすべてのところがあります。 さらに、めでたく組み換え体の細胞がとれて、それがネズミになったとき、 遺伝子型の判定がクリアにできることはかなり重要です。 genotypingもネズミの数が増えるとけっこう力仕事なので。 がんばってください。

(無題) 削除/引用 No.1801-5 - 2009/12/24 (木) 11:41:56 - おお >[Re:4] NFさんは書きました : > おお様、お返事ありがとうございます。 > > ＞＞直鎖化した方が細胞にインテグレーションされるプラスミドの数をコントロールしやすいようです。 > > これは、どういったことでしょうか？ランダムにゲノムに挿入されるプラスミドが少なくなるということでしょうか？ 多分そういうことでいいかと思います.

(無題) 削除/引用 No.1801-4 - 2009/12/24 (木) 11:37:54 - NF おお様、お返事ありがとうございます。 ＞＞直鎖化した方が細胞にインテグレーションされるプラスミドの数をコントロールしやすいようです。 これは、どういったことでしょうか？ランダムにゲノムに挿入されるプラスミドが少なくなるということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1801-3 - 2009/12/24 (木) 07:41:06 - おお >[Re:2] NFさんは書きました : > targeting初心者さまの質問に興味がある者です。 > 以下の点について便乗質問を許していただければ幸いです。 > > Ｑ．targeting vectorは必ずlinealizeする必要があるのでしょうか？また、linealizeしなければ、targeting効率はどのくらい低下するものでしょうか？ 効率という点では答えにくいですが、直鎖化した方が 細胞にインテグレーションされるプラスミドの数を コントロールしやすいようです。特にESなどの細胞で エレクトロポレーションを使った系では。 >[Re:1] targeting初心者さんは書きました : > ある遺伝子のfloxed alleleを作ろうとしているtargeting初心者です。 > 私のconstructはleft homology Arm(7.5Kb)-LOXP-exon1-LOXP-Frt-PGKNeo-Frt-right homology Arm(5kb)-HSVTK で並んでいます。そこで質問なのですが、ES cellにelectroporationするためのlinealizeの際には、left homology Armのすぐ５’外側 > で切らなければならないのでしょうか？HSVTKの３’側には、500bpsばかり離れた所に使えるサイトがあるのですが、left Arm側にはone cutのサイトがなく困っています。HSVTKの３’側でlinealizeした場合、targeting効率の低下が予想されるでしょうか？ > もしどなたか御存知でしたら、お教え頂ければ幸いです。 理論上大きな差はないと思います。無責任なコメントということで いうならばやってみればいいかと思います。 全くダメということはないと思いますし。

便乗ですいませんが・・・ 削除/引用 No.1801-2 - 2009/12/23 (水) 12:19:52 - NF targeting初心者さまの質問に興味がある者です。 以下の点について便乗質問を許していただければ幸いです。 Ｑ．targeting vectorは必ずlinealizeする必要があるのでしょうか？また、linealizeしなければ、targeting効率はどのくらい低下するものでしょうか？

targeting vector のlinealizationの位置 削除/引用 No.1801-1 - 2009/12/22 (火) 12:33:58 - targeting初心者 ある遺伝子のfloxed alleleを作ろうとしているtargeting初心者です。 私のconstructはleft homology Arm(7.5Kb)-LOXP-exon1-LOXP-Frt-PGKNeo-Frt-right homology Arm(5kb)-HSVTK で並んでいます。そこで質問なのですが、ES cellにelectroporationするためのlinealizeの際には、left homology Armのすぐ５’外側 で切らなければならないのでしょうか？HSVTKの３’側には、500bpsばかり離れた所に使えるサイトがあるのですが、left Arm側にはone cutのサイトがなく困っています。HSVTKの３’側でlinealizeした場合、targeting効率の低下が予想されるでしょうか？ もしどなたか御存知でしたら、お教え頂ければ幸いです。

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