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(無題) 削除/引用 No.1794-23 - 2009/12/22 (火) 11:33:31 - みみ 他の方もコメントしてますが，プラスミドの精製度合いの方がずっと大きいファクターなので，「必要量」を考えることに実際的な意味はほとんど無いと思います。 ＞よく理解しないまま、これで切れてるんだからイイじゃんみたいな、テキトウな実験をするのは嫌いな性格なので。。 この定義で言うと，分子生物学的手法のほとんどは「テキトウな実験」になるのでは。

(無題) 削除/引用 No.1794-22 - 2009/12/22 (火) 11:25:17 - おお >[Re:20] Qさんは書きました : > ＞ミカエリス-メンテン機構やリンデマン-ヒンシェルウッド機構から考えて > > 不謹慎ながら、笑っちゃいました。 > 制限酵素でそこまでむずかしく考えるのかって。 わたしは考えるのはいいと思いますけどね。 もしかしたら、そこから新しい発想を得てタカラとかに就職して、 すごい便利な酵素を作ってくれるかもしれないですし。 でも、プラスミド作っているんだったらこのことは追及してても良いですけど さっさと混ぜて実験しないと上司に見捨てられてしまいますよ。

(無題) 削除/引用 No.1794-21 - 2009/12/22 (火) 09:31:32 - ami >比です だから比を取ってる根拠がわからないんですって、僕には。 - - どういうモデルを想定し、比を取ってるのか。さっぱり。 それぞれの制限酵素が１制限酵素サイトを切る時間とか、誰も測ってないですよね。 まぁどうなんでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1794-20 - 2009/12/22 (火) 09:10:49 - Q ＞ミカエリス-メンテン機構やリンデマン-ヒンシェルウッド機構から考えて 不謹慎ながら、笑っちゃいました。 制限酵素でそこまでむずかしく考えるのかって。 私は制限酵素を道具として考え過ぎなのでしょうか、 それとも制限酵素１つでここまでむずかしく考えることができるゆとりがあるのか、 がんばってください。

(無題) 削除/引用 No.1794-19 - 2009/12/22 (火) 08:53:32 - AP プラクティカルな話をすれば、切り出しのときのように、限られたサンプルを完全消化する場合は、計算上の酵素量の10〜20倍（たとえば1 ug DNAにたいして10 U/uLの酵素を1〜2 uLとか）、あるいはそれ以上、使って然るべきです。 ・プラスミドには制限酵素が効きにくいし、純度が低ければより多くの酵素が必要になるので手製で精製したプラスミドだと理論上の必要最小限の酵素では完全消化しない場合も多い。酵素をケチって、少しでも切れ残りが出てしまうほうが、時間とコストの無駄につながる。 ・希釈した酵素の安定性はまったく当てにならないので、希釈して残った酵素をとっておいても無駄になるだけ。原液で計り取れる分量で使った方が合理的。 これがたとえば、スクリーニングなどで多数のサンプル同時に切る場合なんかだと、それぞれのサンプルに酵素を1 uL、全部で100 uL使うなんてのはもったいないので、一サンプルあたり必要最小量になるような酵素を含むプレミックスを作ってから各サンプルに分注するということはありますけれど。

(無題) 削除/引用 No.1794-18 - 2009/12/22 (火) 08:19:09 - ： まぁ、私には知的好奇心に含まれるような話題には思えないので、そちらの話はしませんが、 予算がないから節約したいという話では言わせてもらうと、 ピペットマンで量り取れる量はせいぜい0.5マイクロリットルくらいでしょうか、 酵素液はスティッキーなのでそれすらもちゃんと出来ないと思いますけど、 それを計算でどうこうやって希釈したりして加えるとして（何で希釈するかも問題）、 希釈した溶液を取っておくのは私はあまりお勧めしません。 酵素やタンパク質は濃度が低くなると活性等を維持することが難しくなり、 保存には適さないからです。 偶然誤差の話をしだしたらきりがないとおっしゃいますが、 必要最小限で切れなかったり、次のライゲーションなどの実験を失敗したりする危険性が 増大するようにしてまでケチるより、１回の実験で確実にいけるという方を取った方が よっぽどお金の節約になると思いますがねぇ。 あと、こんなことで議論する時間がよっぽど無駄なことであると思うような話題です。 私がボスだったら、いいからさっさと実験してより確実にやれるような条件でしろって 怒ります。

(無題) 削除/引用 No.1794-17 - 2009/12/22 (火) 07:51:41 - AP >じゃあ、その理論だと仮に1ｇ中に1分子しか存在しない場合と、1ｇ中に10000000分子存在する場合の酵素量は同じでいいということですか？ そういうことです。 そもそも制限酵素消化のkineticsは、ミカエリス・メンテンで扱うような基質と酵素が自由に拡散して衝突するモデルとは違って、それよりはるかに速いそうです（なので、必要最小限の制限酵素認識配列をもつオリゴDNAを基質にでもしている場合でもない限り、通常の酵素反応kineticsを持ち出して考えるのは不適切）。それを説明するモデルとしては古くは、酵素が非特異的にDNAに取り付いて、DNA上を走査して認識サイトにぶつかると切断するというものが提唱されていました。最近のモデルはどうなっているのかよく知りませんが、基本線はかわっていないと思います。 ひとつ論文を見つけましたのでリンクします。本論は難しい式が出てきてさっぱり理解できませんでしたが、イントロは良いレビューになっていると思います。 ttp://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B94RW-4V1DH4H-S&_user=10&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&_docanchor=&view=c&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=3b2c13555f6972cd62eb93e35f0be87c

(無題) 削除/引用 No.1794-16 - 2009/12/22 (火) 02:34:14 - 愛媛みかん Amiさん＞ 比です。5/48502： 2/6000 =1units：X units 　　　　　→(2.0g x X units)÷15units/マイクロリットル=答 APさん＞ じゃあ、その理論だと仮に1ｇ中に1分子しか存在しない場合と、1ｇ中に10000000分子存在する場合の酵素量は同じでいいということですか？ おおさん＞ どちらかといえば生化学ですが、ただの知的好奇心からの質問です。 あとは前者と後者では必要量が異なるので、研究室の費用面からなるべく節約したいからです。 制限酵素もモノによってはかなり高いですしね。。 in situさん＞ 後者をミカエリス-メンテン機構やリンデマン-ヒンシェルウッド機構から考えてみたらどうですか？

(無題) 削除/引用 No.1794-15 - 2009/12/22 (火) 01:12:08 - in situ 制限酵素の未反応時の挙動による気がします。 制限酵素が未反応時も基本的にDNAに近接している（DNAの存在により動きが束縛され、DNAの体積に比例した限局された空間を動き回る）のであれば、�Aが正しいでしょう。 制限酵素が溶液中をランダムに飛び回っており、標的配列と出会ったの場合に切断する場合は、DNAの体積は溶液の体積に比べてきわめて小さいので�@が正しくなると思います。 おそらくスレ主さんは後者の立場で言っていると思いますが、制限酵素はDNAに対して（標的配列以外にも）親和性はあると思われること、後者の立場だと酵素反応の非常に大きい速度を説明しづらいことから、自分としてはやはり前者の立場に賛成です。

(無題) 削除/引用 No.1794-14 - 2009/12/22 (火) 01:06:27 - おお あー、どうだろう。。。。 もしかして制限酵素の性質とか生化学的な実験をしてるんでしょうか、 なにかヌクレアーゼがあってそのポジコンとかでEcoRIつかったり、、、 ならば厳密性は理解できるのですが、、、、 分子生物学てきな(といいますかプラスミドに入れるとか)だと 厳密な必要量より過剰量をいれます。完全消化が必要なことが おおいので。

(無題) 削除/引用 No.1794-13 - 2009/12/22 (火) 00:21:59 - AP 基本的に一時間で完全消化するには1 ug DNAあたり1 unitという考え方でいいと思います。ただし、スーパーコイルのDNAに対しては制限酵素は効きにくいので、酵素によってその数倍から数十倍量が必要です。これが、教科書やメーカのインストラクションで通常いわれていることではないでしょうか。 それぞれの酵素で、何倍くらい過剰に入れたらいいかはメーカのカタログ情報に出ていると思います。 完全消化するということは、全DNA中にある認識サイトに必ず酵素がぶつからなかればなりません。それが起こるには、認識サイトに関係なく全DNAの全長にくまなく酵素がぶつかる必要があるはずで、制限酵素サイトが何箇所あるか、DNAが何分子あるかに関係なく、DNAの総量（総重量）に比例して必要な酵素量が決まってくるものだと考えます。 認識サイトの数に応じて単位数を増やすなんてのは怪しげな考えではないかと思っています。そういうことを書いているあるメーカの冊子（メーカ自体の情報ではなく、日本のディーラーがどこかの先生を神輿に担いで出しているやつ）があるのは知っていますが、逆にそういう主張をしている資料はそれ以外知りません。

(無題) 削除/引用 No.1794-11 - 2009/12/22 (火) 00:03:36 - ami 酵素が制限酵素サイトに到達したときに、そこを切断するのにかかる時間がほぼ０だとすると、�Aが正しい。同じ量のDNAを酵素が総なめするのにかかるunit数が同じ、ということ。 ＞�@は、まずラムダDNAで表した活性を6000bpに換算しなおし �@は、、ここの計算が、、何をもとに換算しているのか、よく分からない、、

(無題) 削除/引用 No.1794-10 - 2009/12/21 (月) 23:24:12 - 愛媛みかん ラムダDNAで行っていた反応を6000bpに換算して考え直してるから、ミカエリス・メンテンの式からも、�@が正しいのではないのですか？

(無題) 削除/引用 No.1794-9 - 2009/12/21 (月) 22:46:44 - ami ＞テキトウな実験をするのは嫌いな性格なので。。 ＞偶然誤差とかの話をしだしたらキリないのでは？ 理論の話がしたいのか実際の話がしたいのか全然分かりませんが、、 �@も�Aも正解とは言えないでしょう。 酵素反応は衝突の問題でもあるから、反応液中での濃度が下がれば全体での酵素活性も低くなる。 制限酵素サイト数で合わせていいんですか。100000bpに制限酵素サイトが１つあるDNAと、1000bpに制限酵素サイトが１つあるDNAと、同じように切れますか。 実際の話をすればどちらで計算しても間違いだし、理論の話をしてもどちらも正解とは言いがたい、ということでよろしいかと。

(無題) 削除/引用 No.1794-8 - 2009/12/21 (月) 22:18:13 - 愛媛みかん 偶然誤差とかの話をしだしたらキリないのでは？ １時間っていうのは、活性定義が１時間になってたからです。 もともと�@の計算式では6000bpに換算しなおしたので。

(無題) 削除/引用 No.1794-7 - 2009/12/21 (月) 21:39:33 - ami ＞すみません。よく理解しないまま、これで切れてるんだからイイじゃんみたいな、テキトウな実験をするのは嫌いな性格なので。。 ＞それに、私の研究室はお金がないので、あまり無駄使いはできないんです。。 テキトウかそうでないかの問題ではなく、計算でどこまで決められるのでしょうか。 例えば、研究室のフリーザーで保存されている制限酵素が元の活性を保っているかはどうしますか。保存状態が悪ければ、活性が1/10になっていてもおかしくないと思いますが。どこまでの活性低下を想定しますか。低下していないという仮定をおくことはできないと思いますし。 Bufferのはかり取りもメーカーより不正確だと思いますが、メーカーでのテスト時と同じ活性が得られるのでしょうか。 DNAの精製度は同じでしょうか。 ＞最低酵素量は １時間で切るという前提を置いている理由は何ですか。 思いつくままに例えばの話をあげましたが、いかがですか。

(無題) 削除/引用 No.1794-6 - 2009/12/21 (月) 21:19:26 - 愛媛みかん 774さん＞ �@は、まずラムダDNAで表した活性を6000bpに換算しなおし、標的DNA 1マイクログラム切るのに必要なunits/マイクログラムを導きだします。 そして、この標的DNAは２マイクロｇあるのだから、必要なユニット数は6.47 unitsとなります。 そして、この酵素の濃度は15units/マイクロリットルなので、求める必要な酵素量は0.4311マイクロリットルとなります。 というのは、わかるんですが、�Aは…？（汗） ：さん＞ すみません。よく理解しないまま、これで切れてるんだからイイじゃんみたいな、テキトウな実験をするのは嫌いな性格なので。。 それに、私の研究室はお金がないので、あまり無駄使いはできないんです。。

(無題) 削除/引用 No.1794-5 - 2009/12/21 (月) 18:34:46 - ： では、解答をして差し上げては？

(無題) 削除/引用 No.1794-4 - 2009/12/21 (月) 18:21:22 - 774 実用的には：さんの仰るとおり、反応系の1/10くらいを加えておけば問題なく実験は進むでしょうが、 理論として理解しておいて損はないと思います。 トラブルシューティングの一助となることもありますし。 質問者さんもどうするべきか悩んでるというよりは、どちらが正しいのかを知りたい。という感じで質問してるのではないでしょうか？ いずれにせよ、計算式の意味を考えることが重要かと。

(無題) 削除/引用 No.1794-3 - 2009/12/21 (月) 17:22:39 - ： う〜ん、どうしてそんなに難しく考えなくてはならないのでしょうか。 反応溶液の1/10~1/20の酵素を加えるって感じでいいと思いますが・・・ 酵素液を加えすぎると酵素液中のグリセロールに由来するグリセロールが スター活性の原因になるかもしれませんが、1/10で問題になったことはありません。 最小を加えるといっても、１マイクロリットル以下を計り取るのは難しいでしょうし、 そんなにけちけちやるよりは結局早かったりすると思いますが・・・。

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