全17件 ( 1 〜 17 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1791-17 - 2010/01/17 (日) 16:57:05 - isso アンピシリンはいいですが、IPTGとX-Galも溶解したAgarに一緒に混ぜてるのですか？通常は塗布しますが・・・> IPTGもX-GALも混ぜております。 おおさま＞ ありがとうございます。 ただ、今回は、PCR直後のligationはうまくいかず、ゲル抽出したものを凍らしておいた後のものがうまくいくという結果でした。 なんだか、結局、大腸菌（JM109）の青発色が悪いことと、ligation効率が激的に低下したことが敗因のような気がします

(無題) 削除/引用 No.1791-16 - 2010/01/17 (日) 08:56:01 - おお 随分昔の質問で忘れている部分もありますので、変なことを 申し上げていたらすいません。 昔網羅的にPCRフラグメントをプラスミドに入れるという力仕事 のプロジェクとをしているのを見てたことがあります。 とにかくPCRして反応溶液を直にプラスミドにほりこむといった 流作業でそこそこうまくいっていました。しかしながらひとりの テクニシャンだけどう言う訳かうまく行かなくなってしまったの ですが、よくきくとその人だけPCRプロダクトを凍結して次の 日にライゲーションしていました。 それだけでうまく行かなくなるとは思えなかったのですが、 凍結したPCRプロダクトを融解したものをみてみると、濁ってました。 PCRの反応にはベタインをデフォルトで入れていてどうもそれが 析出していたようです。で直感的にもしかしたらベタインの析出が いたずらしている可能せいがあるから、とにかくPCRしたら直ぐに ライゲーションまでするようにいったら、またワークするようになった という経験があります。 ただうまく行かなくなったというのはコロニーが栄えてこなくなった ということでちょっと違うのですが、プラスミドにLACZの代わりにスーサイダルな遺伝子をいれている系でしたので、もしかしたら同じようなことがおこっているとおもえました。

(無題) 削除/引用 No.1791-15 - 2010/01/17 (日) 08:37:27 - snow アンピシリンはいいですが、IPTGとX-Galも溶解したAgarに一緒に混ぜてるのですか？通常は塗布しますが・・・

(無題) 削除/引用 No.1791-14 - 2010/01/17 (日) 01:23:40 - isso プレート中の X-gal あるいは IPTG にムラがあるだけでは。＞ プレートを作るときには、LBmediumの中にアンピシリン、X-gal、IPTGをいれてまぜた後に、plateに分注してますので、ムラはないと思います

(無題) 削除/引用 No.1791-13 - 2010/01/17 (日) 00:57:45 - isso 何度かおこなったのですが、うまくいくときといかないときがあります。 つまり、whiteコロニーをrerlateすると白のまま→しっかりinsert入っていることがあります。 以前は、毎回うまくいっていたのですが・・・ おなじゲル抽出productを使っても、うまくいくときと、いかないときがありました。ですので、PCRが問題ではなさそうです。ligationの問題なのかしら・・・ 実験の都合上10個以上のコロニーが必要なので、１コロニーだけ入っていればよいというわけにはいきません。

(無題) 削除/引用 No.1791-12 - 2009/12/22 (火) 10:50:22 - 通りがかり プレート中の X-gal あるいは IPTG にムラがあるだけでは。

(無題) 削除/引用 No.1791-11 - 2009/12/22 (火) 10:23:32 - ~ >もとのレプリカは城のままですし、別のPCR産物は、replateして何時間たっても白のままのもあります。 >PCR産物はゲルきりして、ligationしております 原因が分からないので、一度他の産物のついでにシークエンシングしてみてはいかがでしょうか。 Tが削れているのか、ごみが入っているのかで、今後の方針は変わってくると思います。 または、始めのプレートからできるだけたくさんの白コロニーを取ってレプリカを作り、 レプリカでも白いクローンが出るかを見てみてはいかがでしょうか。 目的のフラグメントもライゲーションに持ち込まれているでしょうから、 数さえ拾えば取れるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1791-10 - 2009/12/21 (月) 21:54:43 - isso ＞はじめに撒いてレプリカの元となったプレートは、 今でも白コロニーは白いままでしょうか。 薄い青のコロニーが、冷蔵庫においておくと濃い青になることはあります。 ところで、PCR後ぶ目的のバンドは切り出しているのでしょうか。 低分子のごみの混入する一番の候補はPCRの非特異産物だと思います。 ありがとうございます　もとのレプリカは城のままですし、別のPCR産物は、replateして何時間たっても白のままのもあります。 PCR産物はゲルきりして、ligationしております

(無題) 削除/引用 No.1791-9 - 2009/12/21 (月) 09:50:58 - おお ：さんのいうとおり、つまるところはインサートがちゃんと取れてないので、 ちゃんと取れるにはどうしたらいいか考えるべきかと思います。 チェックポイントはブルー/ホワイトとかいう前に、PCRのできとか フラグメントをゲル抽出したほうがいいとか、ライゲーションは 効いているかとかたくさんあると思いますので、各段階よく考えて みることが大事と思います。 まあそれと同時にこういうことが起こることにたいして、ああだ こおだスペキュレーションすることはわるいことではないと思います けど、実際の実験をすすめることとはわけて考えて実験のほうは 効率よく進むように考えていく方がいいとおもいます。 経験的に(カラーセレクションは好きでないのでそんなにないですけど) は、青になるのは一斉にみんな青になるようではなく、青にかわるのが 遅いクローンもありますし、コロニーの密度によってなりかたも変わるような 感じの感触はあります。 みなさんの指摘のようにインフレームの短い断片とか入り込んで、活性が 弱くなったクローンもあるのではないかとおもいます。 もしそういうクローンがたくさん取れるなら、どこかで短いDNA断片を 持ち込んでる可能性もあると考えれば、改善の方向性の一つのとも いえるかもしれません。考察はここでいろいろされていいかと思いますが ぜひ生産性のある方向で進められることをお考えください。

(無題) 削除/引用 No.1791-8 - 2009/12/21 (月) 09:50:09 - ~ フレームが合ったごみが入っていて活性が低くなる場合、 時間や菌量によって発色する時間が変わるかもしれません。 はじめに撒いてレプリカの元となったプレートは、 今でも白コロニーは白いままでしょうか。 薄い青のコロニーが、冷蔵庫においておくと濃い青になることはあります。 ところで、PCR後ぶ目的のバンドは切り出しているのでしょうか。 低分子のごみの混入する一番の候補はPCRの非特異産物だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1791-7 - 2009/12/21 (月) 08:21:18 - ： もともと、カラーセレクションは参考程度で考えた方がいいと思いますし、 いちいち白くなったとか青くなったとかどうでもいい気がします。 青くなった白くなったって振り回されてもしょうがないです。 目的はクローニングすることでしょ？ ＞最初のコロニーの時点で白くならないはずと思うのですが・・・replateすると青くなるのが謎です。 別に不思議かって言われたら、私はそんなもんなんだとしか思いません。 トランスフォーメションしたものを最初にプレートにまくと、 いろいろなものがプレート上に混在していると思いませんか？ 確かにコロニーとしては数個かもしれませんが、最初のプレートで何らかの理由で うまく青色にならなかったとしても、私はあまり驚きません。 それが、replateすることによって、条件がいい培養条件になるわけですから、 そこで何からしら元のプレートとちがうことってあるんじゃないでしょうか。 最初にも言いましたが、クローニングすることが目的なのでしょう？ だったらとりあえず色を気にする前に、チェックすることをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.1791-6 - 2009/12/20 (日) 17:29:50 - isso ~さん＞ Crackingしかしていないのであれば、インサートが入っていないのか、小さいインサートが入っているのかは区別できませんよね。 ありがとうございます。おっしゃるとおりですが、もし本当に空なのであれば、最初のコロニーの時点で白くならないはずと思うのですが・・・replateすると青くなるのが謎です。 ssさん＞ PCRからやり直したらうまくいく検体と、PCRからやり直してもうまくいかない検体が生じました。

(無題) 削除/引用 No.1791-5 - 2009/12/20 (日) 16:10:04 - ~ Crackingしかしていないのであれば、インサートが入っていないのか、小さいインサートが入っているのかは区別できませんよね。 たまたまフレームが合ったごみが挿入されているのかもしれません。 本当に空なのか、何か入っているのかを確認されてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1791-4 - 2009/12/20 (日) 15:55:00 - ｓｓ PCR産物がわるいのでは？？

(無題) 削除/引用 No.1791-3 - 2009/12/20 (日) 11:33:17 - とおりかがり まずはコントロールがないと無駄に話が広がる可能性があるので、トラブルシューティングなりでもう少し可能性を狭めてからの質問をお勧めします。 http://www.promega.co.jp/lit/pgemt.html

(無題) 削除/引用 No.1791-2 - 2009/12/20 (日) 09:17:45 - isso pGEMベクターにPCR産物をligationし、コンピテントセル(JM109 )に導入し、抗生物質とx-galを加えたLBプレートに撒きました。 きれいに、ブルーコロニーとホワイトコロニーができました。つまり、きちんとPCR産物が挿入されたものと、そうでないものが区別できたと喜んでいました。 念のため、crackingを行うために、ホワイトコローにから１０個低度pick upし再度plateにぬったところ、明らかにホワイトコロニーからとったものが、きれいなブルーになってしまいました。 crakingしたところ、案の定ＰＣＲ産物ははいっていませんでした。もともとブルーコロニーだったものは、もちろん入っていませんでした。 数ヶ月前までは、うまくいっていた実験系なのですが、この2回ほど同様のことがおこっています。 問題としては （１）ligationがうまくいっていないのに、ホワイトコロニーになってしまう。さらにそれをreplateするとブルーになる （２）ligationがうまくいかなくなった この2点だと思います。特に（１）に関しては全く理解できません、皆様助けてください！

TAクローニング：whiteコロニーのはずがreplateでblueになる！ 削除/引用 No.1791-1 - 2009/12/20 (日) 09:12:40 - isso pGEMベクターにPCR産物をligationし、大腸菌（JM09）にtransformationしました。これをplateにまいたところ、きれいに、ブルーコロニーとホワイトコロニーができました。つまり、きちんとPCR産物が挿入されたものと、そうでないものが区別できたと喜んでいました。 念のため、crackingを行うために、ホワイトコローにから１０個低度pick upし再度plateにぬったところ、明らかにホワイトコロニーからとったものが、きれいなブルーになってしまいました。 crakingしたところ、案の定ＰＣＲ産物ははいっていませんでした。 数ヶ月前までは、うまくいっていた実験系なのですが、この2回ほど同様のことがおこっています。 問題としては （１）ligationがうまくいっていないのに、ホワイトコロニーになってしまう。さらにそれをreplateするとブルーになる （２）ligationがうまくいかなくなった この2点だと思います。特に（１）に関しては全く理解できません、皆様助けてください！

全17件 ( 1 〜 17 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---