BioTechnicalフォーラム [１つのプラスミドで２つのタンパクを発現]

(無題)

No.1783-19 - 2009/12/22 (火) 07:48:21 - dai

ご返信を下さった皆様、ありがとうございます。

取りあえず教授と話をし、invitrogenのベクターを考慮する事、
インサートする位置を変えてみる事の二点を試してみる事になりました。

また、何人かの方から『一つのmRNAでやると良い』とのご提案を頂きましたが、それは色々な理由があってできません。

恐らくここで理由を書いても何の問題もないと思うのですが、念の為省略させて頂きます。

ありがとうございました。

(無題)

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No.1783-18 - 2009/12/21 (月) 12:54:00 - ~

>[Re:17] 通りすがりさんは書きました :
> ３つのプラスミドを一度に導入できない理由って何なのでしょう？ちょっと気になったので、どなたかご教示ください。

トランジェントであれば、導入出来ますが。
ステーブルを取るのであれば、導入頻度が計算上は3乗になりますので、
クローンを取るのが大変かもしれません。

Duet-Vectors

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No.1783-15 - 2009/12/19 (土) 15:41:42 - ats

Novagen社で、pBR322系発現ベクターと共存できる発現ベクターDuet Vectorsを販売しています。これを利用して、2つのplasmidに別々にクローン化したらいかがでしょうか。

(無題)

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No.1783-14 - 2009/12/19 (土) 15:34:34 - ats

> １つのmRNAでやる事は実際に代案として考えているのですが、そうしてしまうと色々と問題が起きてしまうのです。。
同じpromoterなら結果は同じような？？続けて翻訳が起こるとやっかいなのか？＞無関係なCDS(薬剤耐性遺伝子・chaperonなど）をはさむと良いかも。それともRNA binding proteinなのかな？？？

> >同じpromoterを同一plasmid上に置くとdeletionが起きやすいので注意してください。
同じ配列間でhomologous recombinationが生じやすくなるという意味です。低温で培養したり、菌株を変えるとある程度は防げますが、...。

(無題)

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No.1783-13 - 2009/12/19 (土) 15:20:10 - dai

>doubleさん

そうです。A,B共にpColdベクターですのでcspA promoterになります。

これら２つのタンパク質は相互作用する予定です。あくまで希望ですが…。

>atsさん

ご返信ありがとうございます。

１つのmRNAでやる事は実際に代案として考えているのですが、そうしてしまうと色々と問題が起きてしまうのです。。

>同じpromoterを同一plasmid上に置くとdeletionが起きやすいので注意してください。

と言うのは、実際にはどういう事なのでしょうか？
ご教授いただければ幸いです。

promoter 1つの方がよいかも

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No.1783-12 - 2009/12/19 (土) 14:53:59 - ats

大腸菌の場合は、promoter 1つで（つまりmRNA一本で）polycistronicな翻訳を行うことが可能です。
具体的には、1st CDSーTAA(stop codon)GGAGatacaccATG...[2nd CDS]の様に、SD配列を1st CDS中もしくはSTOP codonに重ねると効率が良いようです。SD付近の配列は、1st CDSと同じにした方が翻訳の効率がそろうかも？。
同じpromoterを同一plasmid上に置くとdeletionが起きやすいので注意してください。

(無題)

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No.1783-11 - 2009/12/19 (土) 10:12:06 - double

>>daiさん
有難うございます。
とすると繋ぎ方は
cspA promoter-lac operator-cspA 5'UTR-A遺伝子-cspA 3'UTR-cspA promoter-lac operator-cspA 5'UTR-B遺伝子-cspA 3'UTR
でしょうか？
それともB遺伝子は完全に他のベクターから異なるpromoter等を持ち込んでいるのでしょうか？

また「二つ同時に」という事ですが、とするとこれらタンパク質は相互作用する可能性があるのでしょうか？
極端に言えば、片方プロテアーゼで片方その基質とか。
仮にそうだとしてもそれが大腸菌内で起こるかどうかはわかりませんが。

(無題)

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No.1783-10 - 2009/12/19 (土) 08:41:21 - dai

>おおさん

切り出す前は普通に発現していました。

『発現できる場所を探す』と言うのはあるかわからない宝を探すみたいな感じになってしまうのですね。
ご提案頂いたインビトロジェンのベクターの使用を考えてみたいと思います。
ご助言ありがとうございました。

>doubleさん

ご返信ありがとうございます。

まず、１つ目の遺伝子(Aとします)と２つ目の遺伝子(B)をそれぞれ別のベクターに挿入し、発現を確認しました。
その後、Aの3'UTR後に制限酵素サイトを作成し、更にBのpromoter～3'UTRまでを両端に制限酵素を付加しつつPCRで増幅しました。
これらをライゲーションし最終目的のプラスミドを作成しました（失った部分はありません）

シークエンスは全て確認しています。

発現は単独で発現させた場合、CBB stainingで充分に確認できる量だった為、全てCBBで確認しています。

(無題)

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No.1783-9 - 2009/12/19 (土) 07:57:13 - おお

>[Re:7] daiさんは書きました :

>
> と言う事は、この遺伝子を挿入する位置を変更する事で、もしかしたら発現するかも知れないという事でしょうか。

あ、これ返事に困っちゃうなぁ、、、、
つまるところはそうなんですが、なんの確証もないの、
こっちがダメらなあっちとかやっててきりがないっていう
可能性もありますので、、、、無責任にその可能性があります
っていいにくいです。

ま、そうは言ってもこたえは"その可能性はあります"ですけど。
タグなしで、そこから切り出す前は発現していたわけですよね。

(無題)

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No.1783-8 - 2009/12/19 (土) 07:47:27 - double

>>トピ主様
もう少し詳細に作成の流れを提示して頂けると有難いです。
また、新たなプロモーターやら遺伝子、UTRの挿入によって何かしらベクター上で失われた物がないか？またそれをどうやって確認したのか、発現の確認方法（CBB？WB？）等。
具体的なSuggestionはできないかもですが、後学の為にも宜しくお願い致します。

(無題)

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No.1783-7 - 2009/12/19 (土) 07:36:57 - dai

>TK-1さん

ご返信ありがとうございます。
もう１つ別のプラスミドをトランスフォーメーションする予定があります。
３つのプラスミドをトランスフォーメーションをするのは不可能と聞いたので、一つにまとめる方法を考えました。
IRESというのはどういった機能を持つのでしょうか？

>おおさん

度々ありがとうございます。
質問が不十分で申し訳ありません。バクテリアです。
使用しているベクターは、pColdシリーズの内tagを持っていないもの（pColdIV）を使用しています。

>理論上発現してもいいのに発現しないといっていいかもしれません。
>どこか上流の配列とかがサプレッサーが導入される配列と一致して
>しまったとかありうるかなぁという考察はできますね。

と言う事は、この遺伝子を挿入する位置を変更する事で、もしかしたら発現するかも知れないという事でしょうか。

(無題)

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No.1783-6 - 2009/12/19 (土) 06:57:30 - おお

>[Re:4] TK－１さんは書きました :
> > あとUTRは蛋白発現にはあまり必要でなく、UTRで
> > ポストトランスレーショナルなレギュレーションが
> > かかることがあります。
> UTRでpost-translational regulation? 初耳です。

あ、間違えてました、、うっかりミスです。

(無題)

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No.1783-5 - 2009/12/19 (土) 06:55:30 - おお

>[Re:3] daiさんは書きました :

> インビトロジェンの物はpBudCE4.1という物ですね。これも合わせて検討したいと思います。
>
> プロモーターはpubmedでpColdベクターの配列を調べ、そこに記載されているプロモーター～3'UTRをPCRで増幅しました。
> エンハンサーですか…。ちょっと調べてみます。

あ、バクテリアのようですね。それなら話が違ってきます。
pColdのcspAプロモーターからベクターにあるUTRを含めての発現ユニットを取ってきてるわけですよね。それならまあ妥当なほうほうです。前のコメントは哺乳動物とかの発現に関してのコメントなので忘れてください。

このベクターN末にタグが入ってますけど作ったやつもタグが入るように
してますでしょうか?

理論上発現してもいいのに発現しないといっていいかもしれません。
どこか上流の配列とかがサプレッサーが導入される配列と一致して
しまったとかありうるかなぁという考察はできますね。

(無題)

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No.1783-4 - 2009/12/19 (土) 06:46:28 - TK－１

> あとUTRは蛋白発現にはあまり必要でなく、UTRで
> ポストトランスレーショナルなレギュレーションが
> かかることがあります。
UTRでpost-translational regulation? 初耳です。
UTRはtrnaslational (post-transcriptional) regulationに関与する可能性があり、蛋白の発現に寄与するはずですが。ただ単に発現させたければ、ORFのみに適当なpromoterとpolyAを付ければ一番簡単だと思います。

二つのベクターに分けて入れてco-transfectionでやるには不都合な事情でもあるんでしょうか。あとはIRESを使う手はありますが、IRESの上流と下流の遺伝子で発現量に差が出る可能性はあります。それ以外には2A self-cleaving peptideをリンカーに入れるのも一考かと思います。

(無題)

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No.1783-3 - 2009/12/19 (土) 06:33:50 - dai

おおさん、ご返信ありがとうございます。

ベクターはタカラバイオのpCold vectorを使用しています。

RNAの発現はまだ調べていません。必要であれば検討したいと思います。

インビトロジェンの物はpBudCE4.1という物ですね。これも合わせて検討したいと思います。

プロモーターはpubmedでpColdベクターの配列を調べ、そこに記載されているプロモーター～3'UTRをPCRで増幅しました。
エンハンサーですか…。ちょっと調べてみます。

ありがとうございました。

(無題)

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No.1783-2 - 2009/12/19 (土) 05:07:35 - おお

マンマルとか脊椎動物ようの発現ベクターでしょうか、、、

ポリAシグナルは両方についてますよね?
あとはトランスレーションのスタート位置が適切に
認識されているか、、、、

あとUTRは蛋白発現にはあまり必要でなく、UTRで
ポストトランスレーショナルなレギュレーションが
かかることがあります。

RNAレベルでは発現しているのでしょうか?
もし余裕があれば2つのタンパクを一つのプラスミド
で発現させるためのプラスミドも売っていると思います
ので探してみてはどうですかね。ストラタジーン(アジレント)
とかインビトロジェンあたりだったと思いますが。

くわえてプロモーターということですが、これは何処から
どのように取ってきたのでしょうか、、厳密にプロモーター
というとTATA配列あたりの基本転写因子がつくところで
それだけでは非常に弱いか転写が活性化せずに、上流
とかにエンハンサーが必要だったりします。
エンハンサーとプロモーターの両者を合わせてプロモーター
ということもあるかと思いますので、、、、

１つのプラスミドで２つのタンパクを発現

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No.1783-1 - 2009/12/19 (土) 04:00:39 - dai

大学４年です。知識が足りないのでご教授願えればと思います。

今現在プラスミドの構築をしており、タイトル通り１つのプラスミドで２つのタンパクを発現させようとしています。

１つ目の遺伝子の3'UTRの直後に２つ目の遺伝子(promoter～3'UTR)を組み込み発現させてみました。

結果、１つ目は普通に発現したのですが、２つ目が全く発現しませんでした。
（２つ目単体では発現する事は確認済みです）

質問なのですが、
この様なプラスミドを構築する際、気をつけなければいけない点などありましたら教えて下さい。

よろしくお願いします。