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(無題) 削除/引用 No.1781-10 - 2009/12/19 (土) 15:09:05 - J ＞おおさん、めずらしいですねさん 素晴らしいご意見ありがとうございます。 勉強になりました。 参考にさせていただきます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1781-9 - 2009/12/19 (土) 10:28:32 - めずらしいですね。 >もちろんウエスタンでノックダウンできているかは確認しています。 そうですか。もちろん薬剤をかけたときも、ノックダウンできているかは確認できているのでしょう。 １）ノックダウンでありノックアウトでないのなら、とくにオフターゲットの可能性を否定できません。 ２）ノックダウンなら、それは１００％でない可能性があり（どのくらいですか？）残りのｐ53が効いている。 ３）細胞種によって、反応がちがうことはよくある。 ４）話があったように？元株のｐ53の状態が干渉する。 普通は、p53マイナス（ヌル）の細胞に、ｃDNAをトランスフェクトするほうがベターかもしれませんね。薬剤応答が報告とあまりにも違うなら、そういうコントロールが必要かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1781-8 - 2009/12/19 (土) 09:29:33 - おお Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation. Manzl C, Krumschnabel G, Bock F, Sohm B, Labi V, Baumgartner F, Logette E, Tschopp J, Villunger A. J Cell Biol. 2009 Apr 20;185(2):291-303. Epub 2009 Apr 13. 思い出せないですけど、最近のものでこの辺は比較が見れるかと、、、 あとは文献よんでさかのぼったりしてみてください。 p53KOは随分昔につくられたので、そこからの細胞の 感受性の違いというのは探せば見つかると思いますけどね。

(無題) 削除/引用 No.1781-7 - 2009/12/19 (土) 08:40:28 - J ＞めずらしいですねさん もちろんウエスタンでノックダウンできているかは確認しています。 コントロール細胞はp53蛋白がしっかり発現しているものを用いています。 ただ、p53依存性の薬剤を添加して抗腫瘍活性に差がみられなかったので細胞がおかしいのかなと思いまして…

(無題) 削除/引用 No.1781-6 - 2009/12/19 (土) 08:37:41 - J ＞おおさん コントロール細胞としてはp53が普通に発現している細胞をネガコンとして用いています。 この細胞が最初に述べましたp53Wildの細胞です。 もちろんG418耐性になるよう遺伝子導入もされていますし、p53発現レベルはウエスタンで明らかにしています。 もうひとつだけ質問があるのですが、p53がしっかりと働いている場合、p53依存性の抗がん剤を添加することでp53Wildとp53ノックダウンの細胞で抗腫瘍活性の差ははっきり表れるものでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1781-5 - 2009/12/19 (土) 07:46:57 - めずらしいですね。 p53ノックダウン細胞なんてめずらしいですね。ない細胞たくさんありますから。 とにかく、ノックダウンなのですから、ちゃんとコントロールをとって、ウエスタンでｐ53蛋白が有意に低下していることを確認するべきです。コントロール細胞も普通は必須だと思います。最初にするべき実験です。

(無題) 削除/引用 No.1781-4 - 2009/12/19 (土) 06:39:14 - おお >[Re:3] Jさんは書きました : > ＞おおさん > > 返信ありがとうございます。 > > 今回用いている細胞は他の研究室に分与いただいたものなので詳しくはわかりませんが、p53が働いていることは確認しているようです。 > 直接実験を行い確かめたわけではないので断定はできませんが… この辺の状況はしっかり把握しておいて論文を書く時、 その事について、リファレンスとか場合によっては パーソナルコミュニケーションとかちゃんと対処できるように しておいた方がいいでしょうね。 > > もしきちんとp53が働いている場合では他にどのような要因が考えられるでしょうか？ ファミリーのp63とかp72(もしかしたら数字を微妙に間違えているかもしれません)の関与のほうが大きいとかいう説明も成り立つかもしれません。 > まだ生物を始めたばかりなのでいまいち知識不足でして… > > そもそもノックダウン細胞は変異細胞扱いになるのでしょうか？ p53に関しては、そういう見方でだいたいいいかもしれません。 p53は変異によってはドミナントネガティブの性質をもちます。 ドミナントネガティブの場合はもう一方のアレルが正常で あっても、その効果を打ち消してしまいます。 p53にはファミリーがありますが、そのファミリーに対して ドミナントネガティブの効果があるか私は存じ上げていませんが、 もしそういう効果があるなら、その変異はファミリーの活性も 抑制するが、KDやKOではその効果はえられないでしょう。 しかしながら変異がいろいろな意味を持つ場合があって、 それによりけりだと思います癌でrasの変異はコンスティチューティブ アクティブになっているということなので、ノックダウンしたのとは 全く違うと思います。 癌以外の責任遺伝子の場合、せいかくに変異の役割が分からないもの もありますね. あとG418でセレクションして培養を続けられているということですが、 コントロールとして効果のない同じバックボーンのプラスミドで G418で選択しパラレルに実験した方が、ちゃんとしたコントロール が取れるのでいいのではないかと思いますが、コントロールは どうしているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1781-3 - 2009/12/19 (土) 06:04:33 - J ＞おおさん 返信ありがとうございます。 今回用いている細胞は他の研究室に分与いただいたものなので詳しくはわかりませんが、p53が働いていることは確認しているようです。 直接実験を行い確かめたわけではないので断定はできませんが… もしきちんとp53が働いている場合では他にどのような要因が考えられるでしょうか？ まだ生物を始めたばかりなのでいまいち知識不足でして… そもそもノックダウン細胞は変異細胞扱いになるのでしょうか？ でなければ変異細胞にも関係なく効くエリプチシンでは活性に差が出ると思うのですが…

(無題) 削除/引用 No.1781-2 - 2009/12/19 (土) 02:00:16 - おお まずお使いになっている肝臓癌の細胞は、p53の変異は確認されているでしょうか?p53タンパクの発現は正常肝細胞などと比べて多いばあいは場合によってミューテーションによってドミナントネガティブな蓄積している可能性があります。 TUMOR PROTEIN 53(TP53)と言われる所以です。 お使いの細胞はウイルスゲノムのインテグレーションなど見られますでしょうか? また、その肝癌細胞でp53依存の現象が見られますでしょうかATM、ATR活性化、 p21の発現誘導、DNAダメージなどによるp53の安定化(通常はユビキチン経由 で分解されていて発現が弱い)など。 p53がインタクトでも、上流や下流でシグナルが切断されていれば、 p53は機能してないことになります。

p53ノックダウン細胞について 削除/引用 No.1781-1 - 2009/12/19 (土) 00:45:43 - J 初めてトピたてします。 現在、私は肝がんのp53ノックダウン細胞を培養しています。 p53Wildの細胞と比較することで薬剤がp53依存か非依存かを検討しているのですが、抗腫瘍活性の評価を行ったところ、あまり差は認められませんでした。 そこで、細胞に異常がないかと考え、ポジコンにp53依存のエリプチシンを使ってみたのですが、こちらでも差が認められませんでした。 ただ後で知ったのですが、エリプチシンはp53変異の癌にも効くということらしいです。 ノックダウン細胞には作製時にG418耐性の遺伝子を導入しており、いつも継代時にG418という抗生物質を添加しながら培養しています。 作製時のウエスタンではp53はしっかりノックダウンされていたのですが… エリプチシンで差がないのは細胞の継代のしすぎでもとの肝がんにもどっているからなのでしょうか？ でもG418を入れてもしっかり生きてますし、細胞の形や増殖速度にはそれほど変化してはいないですが… それともp53ノックダウンはp53変異と同じ扱いになるからエリプチシンでも効いているのでしょうか？ 詳しい方是非ともご教授よろしくお願いします。

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