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ありがとうございます 削除/引用 No.1777-9 - 2009/12/18 (金) 10:11:04 - ぺ みなさま、いろいろご意見・アドバイスありがとうございます。 抗生物質なしの培地はコンタミしていないことを確認済みです。 また、リポフェクション時に用いるプラスミドですが2種のヘルパープラスミドはコンタミしておらず、おそらく目的の遺伝子発現ベクターがコンタミしているかと思います。同じロットのヘルパープラスミドとともに別の発現ベクターをリポフェクションしてもコンタミが起こらないからです。 　もう一度エタ沈すれば、滅菌作業をしているのと同じ、というアドバイスを頂きましたので、実行してみます。 　いろいろ、回りくどい言い方をしてしまいましたが、私の不安は、みなさんはエタ沈操作で得られたプラスミドをそのままリポフェクションなどに使用しているのかな？もしかしたら、その後に、特別な滅菌操作をしているのかもしれない、というものでした。おおさんの記述にあるように、それで基本的に問題ないようなので、私の不安は解消されました。もちろん、今回のコンタミの原因が必ずしもプラスミドへのコンタミかまだはっきりした訳ではないので、みなさまのご指摘を参考にし、手技やそのほかの試薬類をチェックしたのち、注意深く実験を進めて参りたいと思います。 　今後ともよろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.1777-8 - 2009/12/18 (金) 09:00:22 - PDI 同Lotのプラスミドをエタチン±で比較してみればいかがですか。 当方でも極々稀にプラスミドがコンタミすることがあります。 その際はフィルター滅菌で解決です。 エタチン操作をクリーンベンチで実施している人もいます。

(無題) 削除/引用 No.1777-7 - 2009/12/18 (金) 08:54:55 - あああ そもそも、抗生物質なしの培地がすでに汚染しているとかは無いでしょうか？ 私ならまず、そこを疑いますけど・・・・・。 培地をほかの人と共有している場合は特に。 プラスミドは普通にキットでprepして、イソプロ→７０％エタノール→滅菌水で溶かしています。 濃度測定まで、特に滅菌操作はしていませんが、今までプラスミドが原因でコンタミしたことはありません。

(無題) 削除/引用 No.1777-6 - 2009/12/18 (金) 08:06:33 - う プラスミドを疑うなら トランスフェクションでコンタミが起こるロットのプラスミドでは、毎回必ずコンタミするのか？ それを調べるだけでもプラスミドが原因かわかる。 もし、プラスミドなら、エタ沈では滅菌作業をしているのと同じだからと気づくべき。 やり直せばいいだけ。 細胞、手技にコンタミを生む原因があると疑うなら、とことん調べるだけ。 これ以上，何を迷うことがあるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1777-5 - 2009/12/18 (金) 07:57:13 - モモ 私はミニプレップで得たDNAをそのままトランスフェクションしてますが、 最近がコンタミしたことはないですねぇ。

(無題) 削除/引用 No.1777-4 - 2009/12/18 (金) 04:52:05 - おお >[Re:3] ぺさんは書きました : > 私はMidprepして最後にエタ沈→乾燥→TEなどに溶かして用いているのですが、みなさんはどうですか？フィルターとか通しているのでしょうか？ エタチン、70%エタノール洗じょうでその後滅菌水でとかして 今のところ問題なしです。

(無題) 削除/引用 No.1777-3 - 2009/12/17 (木) 21:03:02 - ぺ 早速のお返事ありがとうございます。 　以前にも同じことがありましたので確認したところ293Tは抗生物質なしで培養してもコンタミは見られませんでした。その時に、抗生物質ありなしの培地にプラスミドをリポフェクションに用いた量を加えたところ、なしの培地では翌日には細菌？の増殖が見られました。今回もそのように考えていましたが、確かに今回もそこはみないといけませんね。 私はMidprepして最後にエタ沈→乾燥→TEなどに溶かして用いているのですが、みなさんはどうですか？フィルターとか通しているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1777-2 - 2009/12/17 (木) 20:37:03 - ami どこがコンタミの原因か、それぞれを培地に入れてしばらく待って確認しましたか。 > 293T自体にはコンタミはなく どうやって確認しましたか。抗生物質なしで長期間培養して確認しないと、低レベルのコンタミを見逃します。

リポフェクションの際に細菌がコンタミ 削除/引用 No.1777-1 - 2009/12/17 (木) 20:28:15 - ぺ 教えてください。 PEIを用いて293Tにプラスミドをリポフェクションしているのですが、ウイルス上清を回収するころになると細菌がコンタミしていて使い物になりません（いつもなるわけではありません、プラスミドのロットによりけり）。293T自体にはコンタミはなく、おそらくリポフェクションの際に、培地(Opti-MEM・血清なし）に抗生物質がないためだと思っています。現在は、リポフェクション後12時間で培地を通常の培地（抗生物質あり）に変えているのですが、これを8時間か4時間後に行えば防げるのでは？と思っています。如何でしょうか？（もちろん、抗生物質ありの培地のみにプラスミドを入れてコンタミが起こらないことを確認します） みなさんは、このような経験ありませんでしょうか？対処法などあればご教授頂けたらと思います。宜しくお願いします。

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