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(無題) 削除/引用 No.1775-12 - 2009/12/19 (土) 00:11:45 - おお 細かいことですけど、、、、 そのドメインダイセクションをおこなったものが、ホモダイマー(オリゴマー)になるなら、Bの部分が同士がくっついて、Cの部分がターゲットの相手につくっていうのはあり得ますね。 いろいろな可能性を考えてよせていく方がいいかなぁって思います。

(無題) 削除/引用 No.1775-11 - 2009/12/18 (金) 05:47:48 - スラリン みなさん、ご返信ありがとうございました。 みなさんのご指摘で、なんとなく頭の中のモヤが晴れたような気がします。 ドメイン決めをする目的も頭の中ではっきりしていなかったもので・・・。 （１）複数のドメインに分けても、結合部位に関してははっきりしない結果になることがある。その場合、pull-down 等をトライしてみる。 （２）そもそも複数のドメインで本来結合しているかもしれない。これも、pull-down ではっきりする可能性あり。 （３）ドメインが決まってきたら、（立体構造に影響を与えないような）細かい変異で詰めの実験をする。 以上の strategy で今後やっていきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1775-10 - 2009/12/18 (金) 01:27:41 - おお >[Re:6] スラリンさんは書きました : > ＞おおさん > > 歴史の長いタンパク質なのですが、今まで殆ど結合タンパク質が知られてないので、大きなコンプレックス形成はないと思います。 > そうでしょうか、想像の域を超えませんよね。 例えばマスで何種類のタンパクが拾えてきますか? その上流タンパク、下流のタンパクや局在、 輸送、、、それぞれに必要なタンパクがあるとすると どうでしょうか? 報告されているのもはたいてい興味のある結合しか見てないので 大抵は小さなコンプレックスのようなイメージになってしまう のでは? TAP-TAGを使ったコンプレックスのマスの解析とか見ると 一つのタンパクから拾えるものは10個とか少ない方だった とおもいますよ。もちろんそれが全部同じコンプレックス ないにあるか複数のコンプレックスを拾っているのか 分かりませんけど。 アグリやすいという指摘もありますが私もきになってます。 まぁでもこれはちょっとその実験していないので感覚がなく 的確に指摘しづらいです。 コンプレックスフォーメーションに必要なタンパクの ドメインということであれば三つに分けて2つの部分 が結合したでもいいのではないかと思います。 で直接的な結合まで確認して行くのならリコンビナントや 精製したたんぱく質で見てみることが考えられます。 活性や結合の意味でしたら、その結合した部分の過剰発現 でそのコンプレックスがもつ活性(機能)にどのように 影響をあたえるかとか、いうのも一つのアプローチですし、 実際コンプレックスがどうなっているかというのなら 全長やフラグメントを発現させて、コンプレックスの でき方にどのような影響を与えているかとか いう実験も考えられます。 ですから、目的は何ですかと聞き返したくなるわけです。 ノンスペの可能せいを疑っているのならデタージェント の濃度はいじっているので、次に考えるとしたら 塩濃度でしょうかねェ、、、上げていくと相互作用が (特にイオン結合に依存する)弱いものは外れていく 傾向にあると思います。でも弱いからノンスペと いい切れないので、そのへんはよく考えて考察を かいてください。

(無題) 削除/引用 No.1775-9 - 2009/12/17 (木) 16:42:14 - う 別に禅問答をするつもりは無いが ＞よく結合タンパク質のドメイン決めを JBC とかで見るのですが、あんなにハッキリと「ここからここは、結合してない」「ここからここだと結合する」って結果が出るものなんでしょうか？ そういうふうに証明できたものが論文になっているのであって、結果として示すことが出来ているのであって、 それが他のタンパク質で綺麗に証明できないと比較する対照に考えるのは見当違いでは。 論文になっているのと同じタンパク質で、かつ同じコンストラクトを使って質問者が実験しているのであれば話は別だが。 ＞私の周りでは、どうもファジーな結果で、 質問者の周り、とは、同じタンパク質を使っている（もしくは同じようなファミリー）実験者が ファジーな結果になっているのか、 全く違うタンパク質を使っている多数の実験者が、同じプロトコールで実験していて ファジーな結果になっているのか、 これで話が、全く違ってくる。 前者なら、そういうタンパク質を使っている人々なだけかもしれない。 後者なら、一度は実験方法や環境を見つめ直してもいいのではないか？ ＞非特異でないかと・・・。 ファジーな結果といいながら、非特異ではないという自信や、これいかに。

当たり前と言えば当たり前かな 削除/引用 No.1775-8 - 2009/12/17 (木) 16:19:41 - FISH 蛋白質が高次構造を取っていることを考えれば、ドメインがきちっと決まっている蛋白質なら分割してきれいな結果が出るでしょうが，うまく構造を維持できないようなドメイン中の分断をすれば、色々あやふやな結果も出ると思います。 > よく結合タンパク質のドメイン決めを JBC とかで見るのですが、あんなにハッキリと「ここからここは、結合してない」「ここからここだと結合する」って結果が出るものなんでしょうか？ 出る時は出るものです。 > 私の周りでは、どうもファジーな結果で、「おそらくここじゃないんだろうか？」的な結論が多いんですよね・・・。 その先に何がしたいのか分かりませんが、本当に結合部位が知りたいのならば全長をベースに変異や小さなデリーションを導入する等することが必要になってくると思います。ドメイン解析はその前段階の大まかな実験だと思えばいいのではないでしょうか？ また、試験管内の結合実験で見られる結合と細胞内で見られる結合はやはり全く質の違うものだと認識する必要もあると思います。ビーズを水みたいなバッファーでがんがん洗ってしっかり残っているような結合もありますが、生体内ではもっと付いたり離れたりの平衡の上で相互作用が調節されている蛋白質も多いのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1775-7 - 2009/12/17 (木) 16:16:55 - E.coli 自分の経験でも、ベタベタ何でもくっつけてしまうようなタンパク質はありました。しつこく条件検討するか、精製レコンビナント同士でPull-downでもするか、ツーハイとかに走るか、になるんですかね。いづれにしても、タンパク質同士の結合性試験は、操作は簡単ですが、いろんな意味でかなりめんどくさいです…。もちろん、簡単にできるタンパク質もいっぱいありますけどね。

(無題) 削除/引用 No.1775-6 - 2009/12/17 (木) 16:03:17 - スラリン ＞おおさん 歴史の長いタンパク質なのですが、今まで殆ど結合タンパク質が知られてないので、大きなコンプレックス形成はないと思います。 ＞E.coliさん 非特異でないかと・・・。 よく結合タンパク質のドメイン決めを JBC とかで見るのですが、あんなにハッキリと「ここからここは、結合してない」「ここからここだと結合する」って結果が出るものなんでしょうか？ 私の周りでは、どうもファジーな結果で、「おそらくここじゃないんだろうか？」的な結論が多いんですよね・・・。

(無題) 削除/引用 No.1775-5 - 2009/12/17 (木) 15:32:53 - E.coli ノンスペで結合しちゃっているのを疑っているということですか？

(無題) 削除/引用 No.1775-4 - 2009/12/17 (木) 14:44:51 - おお >[Re:3] スラリンさんは書きました : > 説明不足でした。 いえ、理解できていました。 > X と結合するタンパク質を探していて、Y という候補を見つけたとします。 > Y の全長を A,B,C と分けて、B と C が全く重なりがないにも関わらず、共に X に結合してしまったりするんです。 > 異なる二箇所のドメインで結合していることはあまり多くはないと思うのですが、 多くないでしょうか? その結果で、最終的に何がしたいのかで、次の方針が変わるのではないでしょうか。 もしかしたら、やられているタンパクすべてがなにか一つの大きなコンプレックスのなかにすべて存在したりしませんでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1775-3 - 2009/12/17 (木) 13:17:44 - スラリン ＞おおさん 説明不足でした。 X と結合するタンパク質を探していて、Y という候補を見つけたとします。 Y の全長を A,B,C と分けて、B と C が全く重なりがないにも関わらず、共に X に結合してしまったりするんです。 異なる二箇所のドメインで結合していることはあまり多くはないと思うのですが、結構よくこのような事態に陥って困っています・・・。

(無題) 削除/引用 No.1775-2 - 2009/12/17 (木) 13:13:07 - おお それって困りますか、、、、

タンパク結合確認実験 削除/引用 No.1775-1 - 2009/12/17 (木) 13:09:28 - スラリン いつもお世話になっております。 抗体を使って、brain lysate から IP して、結合タンパク質候補をＭＳで確認→recombinant を COS7 に発現させて、結合を確認　ということをよくやっています。 問題はその後でして、結合候補タンパク質を分割していって、どこが結合部位かを確認しようとしたときに、例えば A,B,C と分割した場合、B と C が結合ということが時々あります。 0.3% Triton ではじめ、0.5%→1% Triton と上げていっているのですが、あまりよい結果が得られません。 みなさん、このような経験はないでしょうか？（よくあるので、困っています）

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