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(無題) 削除/引用 No.1774-19 - 2009/12/19 (土) 05:15:17 - レッズ 私のRIPA bufferの組成は下記の通りでした。 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% Na-deoxycholate, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 1 mM Na3VO4, 1 mM NaF, 1 mM PMSF and proteases inhibitors これにTissue powderを入れて、凍結融解を繰り返し、遠心していたのですが、今後TSさんご指摘の溶出方法で行ってみたいと思います。 幸いラボにMDCKのストックのあるので、まずは細胞でポジコンをとってアッセイ系を確立するようにしてみます。今は過去のレスなんかみて、4℃ O/Nで煮沸しないでSDS-PAGEを行ったりしているんですが・・。また報告させて頂きます。

(無題) 削除/引用 No.1774-18 - 2009/12/18 (金) 12:24:59 - おお >[Re:17] おおさんは書きました : > >[Re:16] TSさんは書きました : > > おおさま： > > > 塩は、Lysis bufferでタンパク質を抽出するときの、抽出効率に大きく関わったりするんでしょうか？ > > 塩濃度をあげると遊離してきたり可溶化してくるたんぱく質は > 幾らかあると思います。 低塩濃度で溶出しやすいタンパクは遭遇したことがななあ、、、 疎水相互作用は弱くなるはずですけどね。デタージェント 入れることがおおいから疎水相互作用はあまり塩に関係なく なっているのでしょうかねぇ。

(無題) 削除/引用 No.1774-17 - 2009/12/18 (金) 12:21:12 - おお >[Re:16] TSさんは書きました : > おおさま： > 塩は、Lysis bufferでタンパク質を抽出するときの、抽出効率に大きく関わったりするんでしょうか？ 塩濃度をあげると遊離してきたり可溶化してくるたんぱく質は 幾らかあると思います。例えばクロマチン構成たんぱく質は、 生理的塩濃度ではあまり溶出できませんが、300mM以上に上げると ライセートをにDNAが溶け出てきてどろどろになります。 あとタンパクの相互作用を切る時に高い塩濃度を使うことが ありますよね。細胞骨格に強くついているタンパクとかは そういう理由で溶出が可能になるかもしれないなぁっと。 SDSPAGEのことを考えると塩濃度が低い方がベターですけどね。

(無題) 削除/引用 No.1774-16 - 2009/12/18 (金) 11:39:01 - TS おおさま： えらそうに言うわたしも、TJ専門の研究室に習ったのをそのまま利用しているだけなんですよね。。。 塩は、Lysis bufferでタンパク質を抽出するときの、抽出効率に大きく関わったりするんでしょうか？ たしかに生理的濃度に近いNaClを入れたLysisをつかったりもするんですけど。 深く考えてはいませんでした。

(無題) 削除/引用 No.1774-15 - 2009/12/18 (金) 11:33:01 - おお >[Re:14] TSさんは書きました : > 私はTJタンパク質の総発現量をみるときは、 > 0.3% SDS, 10mM Tris, pH 7.4で可溶化、4分間ボイル、ソニケーション、タンパク質測定、サンプルバッファーと混和、４分間ボイル、SDS-pageです。 > > RIPAバッファーは、いまいち溶けない気がしてるんですよねぇ。。。 なるほどあ、塩は入ってないですねェ。入れなくても大丈夫なのか、 入れない方が効率いいのか、、、、 TSさんの条件がとにかくよさそうですね、実際に実験しておられる ようですし、抽出に関しても感触を持ってらっしゃる人の 発言ですし。。。どうでしょうかとぴ主さん。

(無題) 削除/引用 No.1774-14 - 2009/12/18 (金) 11:24:02 - TS 私はTJタンパク質の総発現量をみるときは、 0.3% SDS, 10mM Tris, pH 7.4で可溶化、4分間ボイル、ソニケーション、タンパク質測定、サンプルバッファーと混和、４分間ボイル、SDS-pageです。 RIPAバッファーは、いまいち溶けない気がしてるんですよねぇ。。。

(無題) 削除/引用 No.1774-13 - 2009/12/18 (金) 11:08:35 - おお >[Re:12] おおさんは書きました : > >[Re:11] TSさんは書きました : > > RIPAの組成がやはり気になるところです。（人によって、結構異なるので） > > TJタンパク質は１％Tritonくらいでは不溶性画分にかなり入ってしまいます。 > > 抽出後、遠心をして不溶性画分を除いているのであれば、ZO1はかなりそっちに行くでしょう。 たびたびです。超音波でほぐしたほうがいいとかあるんでしょかねぇ、、、

(無題) 削除/引用 No.1774-12 - 2009/12/18 (金) 11:06:47 - おお >[Re:11] TSさんは書きました : > RIPAの組成がやはり気になるところです。（人によって、結構異なるので） > TJタンパク質は１％Tritonくらいでは不溶性画分にかなり入ってしまいます。 > 抽出後、遠心をして不溶性画分を除いているのであれば、ZO1はかなりそっちに行くでしょう。 ちなみに私が見つて張った文献は1%TX100、0.5%DOCで0.2%SDSでした たぶん。SDSを0.2%加えたのは見たことがありませんでした。 DOCも今まで見た中で一番高い のうどですね。 この辺がみそなんかなぁって。 ご指摘のように一度不溶画分を調べるとかしながら見ていった方が よさそうですね。それかサンプルバッファーでいっきにやるか、、

(無題) 削除/引用 No.1774-11 - 2009/12/18 (金) 10:38:38 - TS RIPAの組成がやはり気になるところです。（人によって、結構異なるので） TJタンパク質は１％Tritonくらいでは不溶性画分にかなり入ってしまいます。 抽出後、遠心をして不溶性画分を除いているのであれば、ZO1はかなりそっちに行くでしょう。 発現量をみたいだけなら、抽出液が多少濁っていてもサンプルバッファーに混ぜてしまった方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.1774-10 - 2009/12/18 (金) 04:34:36 - おお http://molehr.oxfordjournals.org/cgi/content/full/7/3/279/F1 こちらではRIPAでやっていますが、ちょっとデタージェント濃度が 高いようです。マテメソ確認してください。 組織だと場合によってさらに強い条件が必要な時もあるかもしれません。 セルラインとかでポジコンは取れないのでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1774-9 - 2009/12/18 (金) 03:32:35 - レッズ みなさま　 レスありがとうございます。今までにE-cadherin(110kd)までは問題なく見れていたので、機器の具合は問題ないと考えています。 Zymedの抗体はマウスのWesternは反応しないようです。そこで、好きではないのですが、値段に負けてSanta Cruzを使用しています。ただ、まだバンドがでません。 現在、10% MeOH/Tris-Glycine bufferに0.01% SDSを加えて、PVDF膜(.45)に転写を行っています。 が、どうも泳動、転写の条件はそんなに外れてなさそうですね。 今後、ゲルも染色してみます。 また、現在はマウスですがMDCKも用いてアッセイを行う予定ですので、抽出バッファーから見直してみます。もちろん回収後遠心はして上澄みを利用しています。

(無題) 削除/引用 No.1774-8 - 2009/12/17 (木) 20:49:40 - c SDS-PAGEが目的ならば細胞を普通にSDS-sample bufferで溶かして使えば良いのではないかと思います。ものすごく存在量が少なくて、余計な蛋白質を持ち込みたくないとか, そのサンプルをIPにも使いたいとかそういう事情があれば仕方ないかもしれないですが。あとRIPAでZO-1は十分可溶化できることは間違いないですか。 高分子量領域の転写の改善については最終濃度0.02%くらいでSDSを加えてみてはどうでしょう。時間があるならば何点か振って検討してもいいかもしれません。上限は0.1%くらいみたいです。 転写装置は問題ないでしょうか。スポンジがつぶれてきて密着が微妙に悪くなっていたりとかプラスチックのカセットが湾曲したりひび割れしてたりとかはないでしょうか。これらは転写の良否にかなりの影響を及ぼします。

(無題) 削除/引用 No.1774-7 - 2009/12/17 (木) 19:13:48 - TS ラット消化管、Caco-2細胞、MDCK細胞のZO1、扱ったことがあります。 SDS-page, transferに限って言えば、 6% ゲル、10% MeOH/Tris-Glycine buffer（30V 12 hrと400mA 60 min）であれば、楽勝だと思います。 私の場合、12%ゲル、10% MeOH/Tris-Glycine buffer(100V, 120min)でも全然見えますよ。もちろん、ZO1のみを見るときは、もっと低い濃度のゲルを使いますが。 何か他に考えられる原因はないんでしょうか？ RIPAで抽出したときは、遠心分離とかで不溶性タンパク質を除いたりしていますか？

(無題) 削除/引用 No.1774-6 - 2009/12/17 (木) 18:25:54 - MP MeOHを５%くらいまで下げるのは高分子のゲルからの抜けがよくなるので確かに有効ですが、PVDF膜を使ったほうがいいと思います。 ニトロセルロースは確かメタノール濃度が下がると蛋白の吸着効率が悪くなる、とどこかで聞いたことがあります。間違っていたらすみません。

(無題) 削除/引用 No.1774-5 - 2009/12/17 (木) 13:07:39 - おお 私も6%なら200kDaあたりは楽勝だとは思いますけどね。 T/Cはどうなんでしょうか? ちなみに私の場合は高分子を見る場合はメタノール下げます。 5%位まで。デフォルトは10%で低分子で20%セミドライで、 ニトロセルロース、0.2umのサイズです。

(無題) 削除/引用 No.1774-4 - 2009/12/17 (木) 12:51:19 - み 6%ゲルなら300kDaでもバンドは出ます。 抗体次第でしょう。あと20% MeOHの方が転写効率良いのでは？ ECLなどWesternの検出系は感度が良いのでZO-1でも全く問題ないです。 たしかZYMEDのマウスモノクロがworkしたかなあ（種によって反応性も異なるでしょうが）。記憶が曖昧ですので論文を調べるか、抗体データシートにマトモナwestern写真が載っているものを使用しましょう。 ポンソーやCBB，たとえ銀染色でもバンドが出るのは量的に多い分子または、IPで濃縮した場合でしょうからあてになりません。

(無題) 削除/引用 No.1774-3 - 2009/12/17 (木) 12:16:30 - toyo ZO-1については扱っていませんので一般論になってしまいますが、 ponceau Sで染まるのは蛋白がかなり大量に存在する場合だけで、 ウェスタンブロットの方がはるかに高感度ですよね。 つまりPonceau Sでほとんど染まらなくともバンドがバッチリ出ることは よくありますから、ウェスタンで確認すべきではないかと思います。 (ウェスタンに進むまでに何か問題があるのでしょうか?)

(無題) 削除/引用 No.1774-2 - 2009/12/17 (木) 12:10:17 - おお トランスファー後のゲルに残っているならCBBで染まるはず。 両方になければどこに行ったか、、、あるいはもともとその領域に そのような染色で染まるタンパク量が載ってないか、、、、 マーカーはゲルに残らず移ってますか? ちょっと書いている結論に至った経緯に興味があります。 トランスファーに関しては山ほどここで論議があります ので検索されてもいいかもしれません。 トランスファーが効率よくされていないという前提が 確実ならそれなりの指摘もできますが、私的には そうじゃないのに改善した条件を試してうまく行かない というのは不本意ですから、、、、

高分子のウエスタンブロット 削除/引用 No.1774-1 - 2009/12/17 (木) 11:07:34 - レッズ TJ proteinのひとつであるZO-1 (220kd)の腎臓での発現をウエスタンブロットで評価しようと考えています。 腎臓はRIPA bufferを用いて抽出したのち、SDSサンプルバッファー(2-ME含)を加え、95℃ 5分煮沸しています。SDS-PAGE(6%ゲル)で分離した後、タンク式で転写を行います。 今回、10% MeOH/Tris-Glycine bufferを用いて、30V 12 hrと400mA 60 minと2通り行ったのですが、150kd以上の転写が悪いらしく、Ponceau Sで高分子領域が染まりませんでした。 抗体はInvitrogenのものとSanta Cruzのものと使用予定です。 どなたか経験がございましたら、ご教授下さい。

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