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(無題) 削除/引用 No.176-8 - 2009/03/13 (金) 19:00:30 - ats plasmidの精製度・構成・サイズなどに問題が無い場合、目的タンパクの過剰発現が毒性を示し導入細胞が死んでいる(剥がれている）のかもしれません。 HSV-tk promoterなどの弱めのpromoterに置換してみるか、tet-systemなどを利用し遺伝子導入後、発現誘導してみるのも良いかと思います。 最近の好みは、lentivirusで作製した発現誘導型安定導入株（クローン化しないので細胞集団ですが）を使う事です。

発現強度はたいていかなり幅があります 削除/引用 No.176-7 - 2009/03/13 (金) 04:14:30 - Tb 293などのセルラインにGFPベクターをtransfectionしてFACSでみると、バックグラウンドのあたりから振り切れ直前までかなり幅広い強度分布があります。また、GFP-薬剤耐性遺伝子fusionをいれて薬剤選択すると、GFPがFACSでほとんどみえないものも取れてきますので、FACSではみえないくらい弱いけどでも入っている細胞がさらにいるというのがわかります（この場合はstable transfectionの話し）。すなわち、導入効率というと絶対値のように聞こえますが実は判定方法の検出限界に強く依存するということですね。

(無題) 削除/引用 No.176-4 - 2009/03/12 (木) 20:15:31 - りょう ひえさん御自身が挙げられた可能性の他として： 問題となっている発現ベクターのインサートが無茶苦茶大きい？ promotorがおかしくなっている？ 蛋白はwesternでintactであることを確認済ですか？ あと、免疫染色の過程には問題ないのですか？細胞が剥れるとか。 おそらく条件設定していた時（pmaxGFPを使用していたとき）は染色の過程は無いのでしょ。

申し訳ありません。 削除/引用 No.176-3 - 2009/03/12 (木) 19:27:52 - ひえ 申し訳ありません。手を抜いたわけではないのですが、海千山千の方々に聞けばすばらしいご意見が伺えるかと思いましたので・・・。 可能性としましては、 １．プラスミドの精製度がわるい。（GFPと同じキットで抽出しましたが。一応トランスフェクショングレードです。） ２．産生されるタンパクに毒性がある。 ３．GFPの量子収率が良すぎて、感度に違いがある。 などでしょうか？それぞれコントロール実験すればよいだけの話なのですが、なかなかそこに手を回すだけの時間が無く、先生方にご質問する次第です。

(無題) 削除/引用 No.176-2 - 2009/03/12 (木) 19:04:03 - ats 少なくともご自分で考えた「いろいろな可能性」を提案し、意見を求めましょう。 無駄が省けます。

遺伝子導入効率 削除/引用 No.176-1 - 2009/03/12 (木) 17:16:28 - ひえ いつもお世話になっています。 今ある遺伝子の機能を調べるために、培養細胞に遺伝子導入を行い、タンパクの強制発現実験をおこなっています。まずは目的の細胞への遺伝子導入条件の検討ということで、pmaxGFPというGFPバリアントのレポーターベクターを使って遺伝子導入して、写真判定および細胞溶解液をフルオロメーターすることで定量して条件を決定しています。使っている導入試薬はロシュのFugeneHDで細胞障害が少ないので細胞数で正規化することは行っておりません。 さてこの方法で決定した遺伝子導入条件である遺伝子を遺伝子導入し、それを免疫染色したところ、レポーターベクターと比較して極めて導入効率が低いという結果となりました。いろいろな可能性が考えられるのですが、このような現象についてどなたか解決法も含めてご教授願えませんでしょうか？

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