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Randam hexamerでPCRができるか？ トピック削除
No.1759-TOPIC - 2009/12/15 (火) 10:11:23 - 弱いやつ
single cell PCRを行っています。
採取できるmRNAが微量で、1 step系のPCRではfull volume使用するのでPCRはかかるのですが、2 stepで行うとPCRがかかりません。2 stepでは20マイクロリットル中の1マイクロリットルしか使用しておらずテンプレートが少ないのが問題かとも思います。
1stepではgene specific primerを用いてRT, PCRを行っています。
ただもともとのサンプル量が少ないのでバンドは出ず、PCR産物をもう一度PCRを行って目的のバンドが得られます。各40サイクル。
2stepではRTにrandam hexamerをPCRにはgene specific primerを使用して1 step同様2回PCRを行っています。
cDNAを作って他の分子も見たいので2stepが実験系としてはいいのですが、テンプレートが少ないので1回目のPCR産物は以降どの分子でのprimerが使えるようにしたいのです。
そこでrandom hexamerもしくはoligo DTでPCRができるものでしょうか？
やはりmultiplex pcrをおこなったほうがいいのでしょうか？
分かりにくいと思いますが、ご意見をいただきたく思います。
　
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(無題) 削除/引用
No.1759-10 - 2009/12/16 (水) 09:19:12 - おお
1stストランド合成でランダムプライマーはよくやる方法ですが、
RTをかけるRNA量がかわると条件を設定しにくくなります。
1-5ugのトータルRNAにたいして1/00量のランダムプライマー
を使うのがスーパースクリプトでのプロトコールになっているようですが
これがピコグラム程度のRNAで対応させるならフェムトグラムていどの
ランダムヘキサマーということになります。
あまり現実的でないのと、最適濃度の設定が難しいだろうと
いうのはお気付きかと思います。
なのでランダムプライマーよりオリゴdTのほうが無難だろうと
おもいます。それがかからない理由の一つのようなきがします。
T7を使うRNAの増幅も魅力的だと思います。

ありがとうございます。 削除/引用
No.1759-9 - 2009/12/16 (水) 02:32:10 - 弱いやつ
まずはマルチプレクスをやってみようと思います。

(無題) 削除/引用
No.1759-7 - 2009/12/15 (火) 21:20:03 - あかね
>マルチプレックスPCRはマルチプレックス用のキットでなくても普通のsuperscriptとTaqでできるのですか？

できますよ。Primerの組み合わせをいくつか試して、ちゃんとworkしているかどうか確認することが大事です。

>Randome hexamerでのPCRはかなり危険だと思います。
とは、どんな意味ですか？
やめといた方がいいということです。
理由はrandom hexamerを用いたPCRでどんな反応がおこるか想像するとわかるでしょう。
random primerをもちいてPCRすると、サイクルごとに異なる場所にprimerがアニールして、とても最初のcDNAのポピュレーションを維持したまま、増幅することなど不可能です。その他にも問題が多すぎます。なので、危険としました。

(無題) 削除/引用
No.1759-6 - 2009/12/15 (火) 16:26:37 - 通りすがり
マルチプレックスPCRはマルチプレックス用のキットでなくても普通のsuperscriptとTaqでできるのですか？

(無題) 削除/引用
No.1759-5 - 2009/12/15 (火) 16:24:21 - 通りすがり
Randome hexamerでのPCRはかなり危険だと思います。
とは、どんな意味ですか？

(無題) 削除/引用
No.1759-4 - 2009/12/15 (火) 16:05:43 - あかね
Randome hexamerでのPCRはかなり危険だと思います。

multiplex PCR もよい手だと思います。もちろん2cycle目はnested PCRで
T7 のRNA amplificationよりも手軽ですしね。

(無題) 削除/引用
No.1759-3 - 2009/12/15 (火) 13:20:41 - Pumpkin
TK-1さんのおしゃるように、アレイ用のaRNA合成をヒントに、mRNA増幅したものを使えばいいんではないかと思います。

(無題) 削除/引用
No.1759-2 - 2009/12/15 (火) 11:05:37 - TK−１
Oligo(dT)にT7 promoterでも付けておいてT7 polymeraseで増やせばいいんじゃないですか。

Randam hexamerでPCRができるか？ 削除/引用
No.1759-1 - 2009/12/15 (火) 10:11:23 - 弱いやつ
single cell PCRを行っています。
採取できるmRNAが微量で、1 step系のPCRではfull volume使用するのでPCRはかかるのですが、2 stepで行うとPCRがかかりません。2 stepでは20マイクロリットル中の1マイクロリットルしか使用しておらずテンプレートが少ないのが問題かとも思います。
1stepではgene specific primerを用いてRT, PCRを行っています。
ただもともとのサンプル量が少ないのでバンドは出ず、PCR産物をもう一度PCRを行って目的のバンドが得られます。各40サイクル。
2stepではRTにrandam hexamerをPCRにはgene specific primerを使用して1 step同様2回PCRを行っています。
cDNAを作って他の分子も見たいので2stepが実験系としてはいいのですが、テンプレートが少ないので1回目のPCR産物は以降どの分子でのprimerが使えるようにしたいのです。
そこでrandom hexamerもしくはoligo DTでPCRができるものでしょうか？
やはりmultiplex pcrをおこなったほうがいいのでしょうか？
分かりにくいと思いますが、ご意見をいただきたく思います。
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