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(無題) 削除/引用 No.1756-22 - 2009/12/17 (木) 12:52:02 - おお >ポリシストロニックに発現できるようにも設計してあると思います。 の意味を勘違いされてないかな、、、、、

(無題) 削除/引用 No.1756-21 - 2009/12/17 (木) 11:48:14 - Pumpkin >読み枠が間違っているということはないと思います。 >ポリシストロニックに発現できるようにも設計してあると思います。 僕が気にしているのは、ここなんですよ。大事なコンストラクトのところが、みんな「〜思います」で確認をしっかりとされていないんですよね。先輩が使っていたものだから、インサートDNAを入れ替えただけだから大丈夫と。最初はそうおもっていてもまだいいですが（僕は小心者何んでシークエンス確認しますが）、躓いたら確認できるところはちゃんと確認した方がいいですよ。 やっぱり、一つ一つ確認していかないと、「わけわからなくなったから、もう一度コンストラクト作り直そう」ってことになりますよと。 シークエンスすると言われているのでいいですが、 >インサートについてはシークエンスで確認を取ったのですが、ライゲーション産物については確認していない これだって、ベクターにつないだものが重要であるので、ライゲーションしたあとのクローンを読むことの方が重要ですよね。インサート（ダイレクトシーケンス？）だけみていたって、違うDNA断片やエラーが入った断片がクローニングされてしまったかもしれないし、ライゲーション時になにか起きたかもしれない。どれも否定できないですよね。 と、私は思います。

(無題) 削除/引用 No.1756-20 - 2009/12/17 (木) 08:23:17 - ；； 要領を得んな。。。 ＞以前先輩がほぼ同じ条件でタンパクを確認しているので、読み枠が間違っているということはないと思います。 ＞インサートについてはシークエンスで確認を取ったのですが、ライゲーション産物については確認していないので、確認してみようと思います。 この２つから、一体どういう状況なのか、何を言っているのかわからん。 ここで質問する前にちょっと基本を勉強しないと、話が通じていない気がしてならない。 ＞先輩のライゲーション産物と同じ条件のポジコンは現在作製しています。 これも。先輩が作ったコンストラクトでやるのか、自分が作って確認していないコンストラクトを使って条件は同じでやるのか・・・。 自分が何をやっているのかきちんとわかっているか疑問。 用語を使っていても意味がわかっていない気がしてならない。

(無題) 削除/引用 No.1756-19 - 2009/12/16 (水) 21:29:29 - ヤス 〉Pumpkinさん 先ほどのレスにも書いたのですが、以前先輩がほぼ同じ条件でタンパクを確認しているので、読み枠が間違っているということはないと思います。 ポリシストロニックに発現できるようにも設計してあると思います。 〉~ さん 説明不足ですみませんでした。 インサートについてはシークエンスで確認を取ったのですが、ライゲーション産物については確認していないので、確認してみようと思います。 先輩のライゲーション産物と同じ条件のポジコンは現在作製しています。 ~ さんのおっしゃるパターンで確認してみたいと思います。 〉おおさん ライセートが残っていなかったのでポジコンはおいていませんでした。 現在製作しています。

(無題) 削除/引用 No.1756-18 - 2009/12/16 (水) 17:41:14 - ~ >[Re:17] おおさんは書きました : > >[Re:15] ~さんは書きました : > アクシデンタルになにか起こっているのであれば複数インサートありの > クローンをひろって一つだけへんだとかっていうのはあります。 > そんな時はまあそのほかはまず問題ないと考えますね。 気になっているのは、実は他に制限酵素サイトがあったり、 ポイントミューテーションで新しい制限酵素サイトが出来ていないかです。 600bpが適切な長さかと聞いたのも同じ理由です。 (種によるのでしょうけれどもORFが670~700bp位というのを見かけたので) 配列を読んだ話が全く出ていないので、中身を見ずに進めているのではないかと心配になります。

(無題) 削除/引用 No.1756-17 - 2009/12/16 (水) 16:24:47 - おお >[Re:15] ~さんは書きました : > >ライゲーションでつながっていたのでシークエンスの必要は無いと感じていたのですが > トラブルが起きていなければ、省略しても何とかなるでしょう。 > ただ、トラブルが起きているのにその原因の候補の１つを無視できる根拠はないでしょう。 アクシデンタルになにか起こっているのであれば複数インサートありの クローンをひろって一つだけへんだとかっていうのはあります。 そんな時はまあそのほかはまず問題ないと考えますね。 全然どのクローンもだめなら原因が配列によるものでない という確信がないなら一応確認のため読むかもしれません。 その600bpはPCR産物でしょうか? それなら配列を確認した方がいいでしょうけど、どれもこれも PCRでミューテーションがはいって活性がないということは ないです。

(無題) 削除/引用 No.1756-16 - 2009/12/16 (水) 15:52:15 - おお えっとSOD活性を測る時、ポジコンは置いてますか、、、 どなたかやられたことあると言う事なら、その時の ライセートとか残ってますか?

(無題) 削除/引用 No.1756-15 - 2009/12/16 (水) 15:07:32 - ~ ものすごく乱暴な実験をしていると思っていましたが、 過去に同様の系を使っていたのであれば話は変わってきます。 >今回の実験ではその時に入れたインサートを一塩基置換したものを挿入しました。 これ以外は過去に貴方のいるラボで行われた条件なのですよね。 pUC18への入れ方や入る配列が(置換部分を除いて)同じであれば、読み枠はとりあえず置いておいていいと思います。 (ここで複数の人が質問しているように、その作り方では普通は発現しないと思われてしまいます。なぜ発現できるのかは説明できるようにしておいたほうが、発表会では困らないでしょう) まず最初にした方がいいのは、過去に先輩が使ったベクターで、 貴方が活性やタンパク質を検出できるかだと思います。 それがポジコンとなるでしょう。 置換を入れていないインサートを一緒にライゲーションして、並べてみてもいいかもしれません。(先輩のベクターと同じ結果になるはずです) 先輩のベクター（A)と、貴方の一塩基置換のベクター（B)を並べてトランスフェクションした時に、 �@ A：タンパク質○活性○ B：タンパク質○活性× 一塩基置換により活性が失われた �A A：タンパク質○活性× B：タンパク質○活性× 酵素活性の測定方法に問題がある �B A：タンパク質○活性○ B：タンパク質×活性× 一塩基置換により発現量や安定性に影響がでた？ などと、結果について考えることができるようになるでしょう。 SDS-PAGEでバンドが見えないのであれば、市販のanti Mn SOD antibodyを使って、WBで見てもいいのかもしれません。 >ライゲーションでつながっていたのでシークエンスの必要は無いと感じていたのですが トラブルが起きていなければ、省略しても何とかなるでしょう。 ただ、トラブルが起きているのにその原因の候補の１つを無視できる根拠はないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1756-14 - 2009/12/16 (水) 14:35:33 - Pumpkin なんだかatsさんとトピ主さんのレスをみていると >ベクターとインサートは両方ともEcoR�TとHind�Vで制限酵素処理を行ってからライゲーションしているので、きちんとlacZ領域に入っている の回答が全てのような気がしますが、LacZのORF中に目的のインサートが入っているわけですが、LacZのORFの読み枠に目的のインサートの読み枠が一致しないと、少なくとも目的の蛋白質は翻訳されないですよね。LacZの途中に挿入すれば蛋白ができると思ってはいないですよね。 もう一度聞きますが「読み枠はあっているのですか？」 それと、さくさんの質問にあるLacZとの融合タンパク質でいいんですよね？もし、読み枠があっていなければ、途中で終止コドンが入って蛋白質が出来なければSDS-PAGEしたってみえないと思います。 それか~さんの >ポリシストロニックに発現できるようにしているのでしょうか に回答ありませんが、そのようであれば前の質問は忘れてください。

(無題) 削除/引用 No.1756-13 - 2009/12/16 (水) 14:14:16 - ヤス 質問内容が悪くて申し訳ないです。 〉atsさん ベクターとインサートは両方ともEcoR�TとHind�Vで制限酵素処理を行ってからライゲーションしているので、きちんとlacZ領域に入っていると思います。 〉さくさん 一応電気泳動で確認しているので、Mn-SODができていればそれなりにバンドはでると思います。 ですが、今までは全くバンドが見られませんでした。 〉~さん 過去の実験で大腸菌由来のMn-SODは確認されています。 今回の実験ではその時に入れたインサートを一塩基置換したものを挿入しました。 実験条件はその一塩基置換した以外は前回と同じなので、大腸菌による修飾も行われていると思います。 また、同じ理由で培地中のMnも、酵母エキスからのもので足りていると思うのですが・・・。 以前の先輩の実験結果で殆ど条件が変わらない状況で、タンパクが確認できていたので、今回も上手くいってるだろうと甘く考えていたのですが・・・。 制限酵素処理をしたものが、ライゲーションでつながっていたのでシークエンスの必要は無いと感じていたのですが、やった方がいいみたいですね。

追加 削除/引用 No.1756-12 - 2009/12/15 (火) 19:44:24 - ~ Mn SODで600bpというのは短く感じますが、本当に全長(または活性に必要な部分)が含まれているのですか？ Mn SODというからにはMnが無いと活性がでないと思いますが、活性測定時に必要量は添加されているのですか？ それとも培地中のペプトンなどから必要量が供給されるのですか？ この酵素は翻訳後修飾は活性に不要なのですか？ 必要であれば、大腸菌でその修飾はされるのですか？ 大腸菌由来Mn SODの酵素活性を測っている報告はあるのですか？ あるとすれば、その報告と異なる条件はありますか？

(無題) 削除/引用 No.1756-11 - 2009/12/15 (火) 19:28:59 - ~ Kozak配列をつけて、ポリシストロニックに発現できるようにしているのでしょうか？それともLacZのごみをN末につけているのでしょうか？ C末は終止コドンをつければ、C末にごみは付かなくなりますが、つけているのでしょうか？ そのあたりの情報が書かれていないので、ベクターの状態が分かりません。 まだ配列を確認していないように読み取れますので、まだ活性を評価するのは早いと思います。 サブクローニングであったとしても、向きも配列の確認もかかれていませんので、現時点でなぜ活性が見ることが出来ると考えているのかが分かりません。 押さえの実験がほとんど書かれていませんが、 １．ベクターが目的の状態になっている（配列も含めて） シーケンシング ２．現時点の条件でMn−SODがある程度に発現している SDS-PAGEやWB(感度は活性よりも落ちるかもしれませんが) ３．Ms−SODの活性測定の系がワークしている 酵素を購入してポジコンとしてして使用、場合によっては親株を入れた大腸菌に混ぜて添加回収 などはトラブルが起きているのであれば確認したほうがいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1756-10 - 2009/12/15 (火) 18:27:00 - さく 素朴な疑問ですが、マルチクローニングサイトに目的の配列を入れたら、Lacの一部が目的タンパク質につながった状態で発現するんじゃないかと思いますが、そういうのは活性に影響はないのでしょうか？ 発現を活性で見ているようなので…。

(無題) 削除/引用 No.1756-8 - 2009/12/15 (火) 16:13:43 - ats タンパクコード領域は、lacZとフレームが合っているのでしょうか？ そうでないとすると、タンパクコード領域だけが挿入されていても翻訳されませんよ。

(無題) 削除/引用 No.1756-7 - 2009/12/15 (火) 15:48:03 - ヤス プラスミド抽出を行った結果、インサートは上手く入っていることがわかりました。 しかし、インサートが入っている大腸菌を培養し、破砕してもMｎ-SODは得られませんでした。 発現しない原因として １，ＩＰＴＧによる誘導が弱い ２，大腸菌ＪＭ１０９では発現しない ３，ベクターＰＵＣ１８と相性が悪い ４，本培養温度が高い（現在は３７度で行っています） などが考えられると思うのですが、いかがでしょうか。 プラスミド誘導タンパクの発現に強く影響を与えるものを教えてください。

(無題) 削除/引用 No.1756-6 - 2009/12/13 (日) 18:09:54 - ヤス アドバイスありがとうございます！ ）やまさん、おおさん 確かにLacz部分に組み込んでいます。 青色コロニーもいくつかとって破砕してみたのですが、活性は見られませんでした。 トランスフォーメーションした大腸菌からプラスミドを取ってみて、きちんとライゲーションできているか確認してみたいと思います。 それと同時並行でＩＰＴＧなしのシャーレにもまいてみようと思います。 ）ecoliさん 他の大腸菌を試すのは思いつきませんでした。 プラスミド抽出して、ライゲーションが上手くいっていたなら先生と相談してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1756-5 - 2009/12/13 (日) 06:30:26 - おお もう一つ思いつきました、 LacZ活性をみてインサートを確認しているので、 インサートの遺伝子が発現した状態でクローニングを 行ってますよね。もしその遺伝子が大腸菌の 生育にネガティブに働くなら、その条件では インサートの入ったプラスミドをもった大腸菌 は増えにくくなかなか目的のものが拾えない のかもしれません。 IPTGの誘導なしでクローニングしてみて、 インサートを確認し、その後誘導という手順 の方がいいと思えます。

(無題) 削除/引用 No.1756-4 - 2009/12/13 (日) 05:26:28 - ecoli pUCに外来性のものをクローニングしにくいと思います。 SODってことはペリプラスムですよね？ アッセイ系の問題もあるので、 おおさんの言うようにコンストラクトをチェックしたうえで、 クローニングがしにくいとかの判断をしたのち、 pMWとかpACYCとかに入れなおすといいかもしれないです。

(無題) 削除/引用 No.1756-3 - 2009/12/13 (日) 04:26:30 - おお いきなり活性でなくて、まずは目的の インサートがはいったプラスミドが拾った 大腸菌の中にあるか確認するべきでは? あとインサートによっては入っていても 青と言う事はありえます。特にフレームが Laczとあっているとき可能性があります。 タンパクの発現(活性でなくて)をみることは できないのでしょうか? pUCにほりこんでいるところからして、LacZに フレームを合わせているような感じですね、、、、

(無題) 削除/引用 No.1756-2 - 2009/12/12 (土) 18:22:57 - やま 青色が当たりの事も結構あるので青色も拾ってみてはいかがでしょうか？

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