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(無題) 削除/引用 No.1753-10 - 2009/12/15 (火) 00:51:36 - 転写屋 大腸菌のRNase活性は非常に高いです。 ですので、放置時間の長いトライゾールのプロトコールと 相性が悪いです。 私もトライゾールで大腸菌のtotalRNAをとった経験がありますが、 スタンダードなホットフェノール法より収量が1/50程度で且つ バンドもスメっちゃいました。 もし、どうしてもトライゾールでやりたいのであれば、 菌体を10mLくらいから始めるといいかもしれないです。 ネトネトでやりにくくゲノムもかなりコンタミするでしょうが。 ちなみにホットフェノール法ならば、1mLの菌体液でも 100μg程度はとれます。

(無題) 削除/引用 No.1753-9 - 2009/12/14 (月) 18:26:15 - R 私も特に理由がないなら定常期ではなく対数増殖期から集菌すべきと思います。 定常期の培養液1 mLからの菌量って十分なのでしょうか？ 大腸菌からRNAをとっていたのはかなり昔で記憶が曖昧ですが、私は100-250 mL位の対数期から抽出していたように思います。 (十分すぎる量がとれますが) また、水は単なる滅菌水でしょうか？ RNase freeを使っていますか。 水での溶解は加えて放置するだけ？ 混ぜたりはしていない？ 電気泳動は変性ゲルでなくても大丈夫ですが、少なくともRNase freeで調製した方がよいと思います。 また、どれくらいの重量をアプライしているのでしょうか？ (吸光度での確認もされていますよね？) クロロフォルム処理後については、他の方も仰っていますが、中間層をとらないように余裕を待たせた方がよいです。

(無題) 削除/引用 No.1753-8 - 2009/12/14 (月) 17:57:07 - ザンギ 大腸菌は栄養状態でRNA量が１０倍くらいは変動します。 静止期特異的な転写産物をみるんでしょうか？ そうでなければ対数増殖気の大腸菌から回収するほうがいいのでは。

お願いします。 削除/引用 No.1753-7 - 2009/12/14 (月) 12:18:54 - ひい kazuさん、少し遅くなりました； だいたい同じような工程ですね。 私はこのようにやっています。 �@寒天培地で大腸菌を生やし、つまようじで２回ほど菌を多めにすくい取り、 　液体培地１０ｍｌでオーバーナイト �Aエッペンに１ｍｌの培養液を入れ遠心して上清の培地を取り除く �BＴＲＩzol５００μｌ・ガラスビーズを加え手＋ボルテックスで混合し（２分ほど）５分放置 �Cクロロホルム１００μｌを加え手で混合し５分放置後遠心して水相を集める �D上層と同じ容量のクロロホルムを加え手で混合し５分放置後遠心して水相を収集 �C集めた水相に３００μｌイソプロパノールを加え混合し１０分放置し遠心 �D上清を除去し７５％冷エタノール５００μｌを加え、ボルテックスで混合後、遠心 �E上清を除去し１０分程乾燥させた後、滅菌水５０μｌ加え１０分放置 �F電気泳動で確認（変性ゲルを使わずＴＡＥとアガロース、最後にエチブロを使ったもので行っています。）

(無題) 削除/引用 No.1753-6 - 2009/12/12 (土) 23:39:30 - kazu 先日、ＴＲＩzol試薬を使用してカビからＲＮＡ抽出しました。 �@磨り潰した菌体２ｇにＴＲＩzol試薬5ml加え入念に溶かす �Aクロロホルム700μlを加える �B14000rpm/5min/4℃ �C上清を回収 �Dイソプロパノールを等量加える �E14000rpm/5min/4℃ �F上清を捨てる �G70％エタノールでペレットをリンス �H乾燥機で完全に乾燥 �I超純水で溶かして-30℃で保存 抽出直後に変性ゲルでバンドも確認出来ました。 確認方法をもう少し詳しくお願いしたいです。

(無題) 削除/引用 No.1753-5 - 2009/12/12 (土) 09:43:48 - ひい おおさんありがとうございます！ 上層を取る時は半分から3分の１を残した方がいいんですね。 菌数はつまようじに多めに２回取った大腸菌を液体培地１０ｍｌに・・・ 一度クロロホルム処理の過程で上層を取る量を変えて、今日実験したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1753-4 - 2009/12/12 (土) 03:43:10 - おお >[Re:1] ひいさんは書きました : > > ・以上の操作でＲＮＡ抽出は可能でしょうか？ > ・クロロホルム処理後の上層を集める時・中間層ぎりぎりまで取るほうがいいですか？（あまり慣れていなくたまに中間層を取ってしまうこともあります） > 中間層を取らないために半分から1/3を捨てるのが従来のプロトコール です。 最初の菌数的には十分とれる量なんでしょうか? 乾かし過ぎてRNAが解けていないってことはありませんか?

(無題) 削除/引用 No.1753-3 - 2009/12/12 (土) 01:55:07 - ひい あ、検出方法ですが書き忘れていました； 電気泳動をしています。

(無題) 削除/引用 No.1753-2 - 2009/12/12 (土) 00:32:38 - ami > （バンドが出ません） どうやって検出を試みているのですか。

大腸菌からのＲＮＡ抽出（ＴＲＩzol） 削除/引用 No.1753-1 - 2009/12/11 (金) 23:44:09 - ひい ＴＲＩzol試薬を使って大腸菌（液体培地で培養）からＲＮＡ抽出を行っているのですが全くＲＮＡを取ることができません。（バンドが出ません）何故なのかわかりません。 何か少しでもヒントになることがあれば教えてください。 手順は �@エッペンに１ｍｌの培養液を入れ遠心して培地を取り除く �AＴＲＩzol５００μｌ・ガラスビーズを加え手でよく振って破砕後５分放置 �Bクロロホルム１００μｌを加え混合し５分放置後遠心して上層を集める �C集めた上層に３００μｌイソプロパノールを加え混合し１０分放置し遠心 �D上清を除去し７５％冷エタノール５００μｌを加え、ボルテックスで混合後、遠心 �E上清を除去し数分乾燥させた後、滅菌水５０μｌ加え１０分放置 �F冷凍保存 ・以上の操作でＲＮＡ抽出は可能でしょうか？ ・クロロホルム処理後の上層を集める時・中間層ぎりぎりまで取るほうがいいですか？（あまり慣れていなくたまに中間層を取ってしまうこともあります）

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