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(無題) 削除/引用 No.1744-14 - 2009/12/12 (土) 04:14:44 - おお http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;start=6;Code=194 昔こんな記事がありました。 インサートのoriをPCRの時につぶしておくのもてかもしれませんけど、 実験に必要なら違う手を考えた方がよさそうです。違うoriをつかうと 解決方法がありそうですけど、、、 あと薬剤耐性も一緒なので、これって一方をsupEに対応するミューテーション をいれておいて、supEなしでは働かないようにしておくとか、、、、 随分マニアックな実験になってきてますが、、、、

(無題) 削除/引用 No.1744-13 - 2009/12/11 (金) 18:45:39 - やま 全く同じ配列が（しかも長い）同じプラスミド上にあると そこで組み替えが起こりやすく、その間の部分が抜け易くなってしまうと 聞いた事があります。 薬剤耐性遺伝子を変更する事はできないのでしょうか？ oriはベクターとインサートで同じですか？別でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1744-12 - 2009/12/11 (金) 17:43:50 - ザンギ >その通りの実験内容です。 なんか事情がありそうですね。 インサートのoriだけでも潰せるといいんですけどね。 まぁ基本は、おおさんのおっしゃるように目的物しかできないように デザインするんですけどね。 力技も時には必要ですよね。 先にベクターに制限酵素サイトのアダプターを導入できないんしょうか。 検討されましたか？

(無題) 削除/引用 No.1744-11 - 2009/12/11 (金) 13:43:55 - おお >[Re:10] ぷるるさんは書きました : > > ベクターの末端は同じ酵素で切っています。 両者片側ブラントにできないですかね。 そうすればライゲーションしてもセルフライゲーションの確率が 極端に減ると思いますので、ライゲーション後そのまま トランスフォーメーションできると思います。

(無題) 削除/引用 No.1744-10 - 2009/12/11 (金) 13:20:28 - ぷるる >ザンギさん そもそもＰＣＲがあがりにくく収量が少ないので、ライゲーション産物も少なく、確認のためのゲル電でロスってしまうのがもったいないと考え、写真を撮ったゲルから切り出していました。 やっぱり確認にてみようかと思います。 >おおさん 目的位置ですが、ＳＣ用のラダーを使ってその位置を特定しています。 ですが、プラスミドの状態を考えると本当に目的物なのか自信が無いです。 ライゲーション産物をそのまま形質転換して、コロニーＰＣＲとかで確認したほうが得策ですかね？ ベクターの末端は同じ酵素で切っています。

(無題) 削除/引用 No.1744-9 - 2009/12/11 (金) 13:15:48 - realtime ゲル切り出しの際、Mupid Blueを使えばUVは不要です。感度がいまいちですが、隣接のウエルに分子量マーカーを流し推定の場所を切り出せば、何とかなります。しかしゲル切り出しから抽出の際、ニックが入るかもしれないと思っているので、わたしはライゲーションの後のゲル切り出しはやったことがありません。 わたしがやるのであれば、数百個くらいまでクローン拾って、プラスミド由来のPrimerでスクリーニングし続けます。その前にインサートの細胞毒性を確認するため、別のプラスミドにクローニングするかもしれません。 ライゲーションそのものが、うまくいかない場合は、PCRprimerに導入する制限酵素配列を変えるか、ブラントエンドとリン酸化を組み合わせるか、自作TAベクターを作るかぐらいしか思いつきません。

(無題) 削除/引用 No.1744-8 - 2009/12/11 (金) 12:24:55 - おお なるほど、、、ザンギさんのはなしも統合すると 取れるはずだけどなぜか取れてないと言う事になりますね。 どこかがうまくいってませんね。 ライゲーションしてからの切出しですけど、どこに目的の 物があるか分かりますか? ライゲーションでリニアーなプロダクトや環状のものとか 2つだけでなく3つ4つくっついたものなどいろいろなものが 交じりますし、オープンサーキュラーだったら可也大きいサイズに 来るはずです。 両末端はなにか制限酵素で切っているわけですよね。それでセルフ のライゲーションが気になるということは5'と3'の末端は同じ酵素 またはコンパチブルな切断になっているのでしょうか。 ほかの酵素の選択余地はありませんでしょうか、セルフが出ないような、、、

(無題) 削除/引用 No.1744-7 - 2009/12/11 (金) 11:57:59 - ザンギ >ＵＶを当てた状態で写真を撮る 僕なら切り出すゲルは別にして、写真を撮ったゲルは捨てます。 過去スレに沢山あると思いますが、UVはゲルに印をつける間だけ 照射すれば30秒以下で済むと思います。 UVの波長は長いほうが（見た目が暗いけど）DNA損傷が少ないと 言われていました。これについては議論はあるようですが。 変異については普通は、液体培地に移してからの話ですから、 陽性コロニーが拾えないのは別の問題ではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1744-6 - 2009/12/11 (金) 11:50:49 - ぷるる >ザンギさん その通りの実験内容です。 変異のせいなんですかね。 現在はＪＭ109を使っているのですが、菌株変えてやってみます。

(無題) 削除/引用 No.1744-5 - 2009/12/11 (金) 11:46:29 - ぷるる >おお さん お返事ありがとうございます。 実験上必要なのでどうしようもないんです。 それでうまくいかないんですかね…。 >あああ さん どちらもしました。 で、どちらもインサートは確認できませんでした。 ひとつ気になっているのが、ゲル抽出の前にＵＶを当てた状態で写真を撮るのですが、本来ゲル電のための装置ではなくその装置のＵＶの強さがわからないことと撮影に時間がかかるんです(２-３分)。 その辺りの影響って考えられるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1744-4 - 2009/12/11 (金) 11:44:27 - ザンギ 確認ですが 大腸菌で薬剤Aで選択できるプラスミドAに、さらに薬剤A耐性遺伝子を大腸菌 内で働くプロモーター付きでさらにoriも一緒に、つまり別のプラスミドを まるごと挿入したいということですか？ ご質問の内容の実験をするとしても、普通は1.6kbpの産物をゲルから切り出して ライゲーションすると思います。 oriが二つあるとプラスミドが大腸菌内で変異しやすいと言われてはいますが。

(無題) 削除/引用 No.1744-3 - 2009/12/11 (金) 11:34:55 - あああ コロニーPCRとか、ミニプレップとかして、インサートチェックはしてないのですか？

(無題) 削除/引用 No.1744-2 - 2009/12/11 (金) 10:43:18 - おお やっていることがちょっと一般的でないような気がしますけど、 必要とあれば無理がない限り仕方のないことと思えますけど、、、 1.6kbpのPCR産物が薬剤耐性の遺伝子を持っているわけでしょうか? oriが二つになることはないですよね、、、 そういうのはもしかしたらうまくいかなかもしれない と聞いたことがありますけど、、、詳しくは分かりませんが。 まず薬剤耐性の遺伝子が2つ必要ですか?

インサートが抜ける 削除/引用 No.1744-1 - 2009/12/11 (金) 10:19:36 - ぷるる 初めて質問させていただきます。 私は今、約５kbpほどのベクターに１.６kbpのＰＣＲインサートを組み込むクローニングをおこなっているのですが、ベクターとインサートのマーカーが同じため、形質転換時に抗生物質によるセレクションができず、ライゲーション産物をゲル抽出し、それを形質転換しています。 しかし、ライゲーション産物の目的位置のバンドを切り出して形質転換しているにも関わらず、得られたコロニーからはベクターのみしか出てきません。 目的プラスミドを回収するにはどうしたらよいでしょうか？ 教えて頂けると幸いです…。

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