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(無題) 削除/引用 No.1741-18 - 2009/12/16 (水) 15:02:55 - りこんびなんと 大変失礼致しました。 やはり私の大きな勘違いでした。 ゲノム変異の機序ばかりが気になってTｎ10自体について調べていませんでした。 同じメーカーのマニュアルなのに書き方が違っていたものですから (Tcr)と書いていないとテトラサイクリンの耐性遺伝子が入っていないものかと完全に思ってしまっていました。 お時間を取らせてしまいまして本当にすみませんでした。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1741-17 - 2009/12/16 (水) 14:47:58 - 中年 何を疑問に思っておられるのかよく分からないのですが、No.1741-14にご自分でお書きになっているRosetta-gami 2(DE3)pLysSの遺伝子型にあるgor522::Tn10がgor522::Tn10(Tcr)と同じかとお尋ねなのですか？ だとしたら、答はＹｅｓです。Tn10はトランスポゾンの一種でtetracycline耐性遺伝子を持っています。 また、これはTn10を利用して大腸菌のゲノム上のgor遺伝子を欠損させたものなので、培養中にtetracyclineの選択を掛けなくともまず失われることはありません。ストックから起こす時などには念のため選択を掛けた方が良いとは思いますが。

トピ主です。 削除/引用 No.1741-16 - 2009/12/16 (水) 14:35:32 - りこんびなんと gor522::Tn10(Tcr)の意味はおおむね理解したつもりです。 （詳細は未だ勉強中です） 問題は私の使っているRosetta-gami 2(DE3)pLysS株にこの記載がないことです。 テトラサイクリンを加えなくても変異に影響がない旨教えて下さいました方達は Rosetta-gamiBをお使いとのこと。 この株には確かにgor522::Tn10(Tcr)の記載がありました。 Rosetta-gami2とRosetta-gamiBとでは株の由来も違いますので テトラサイクリンについても違いがあるのではないかと心配になった次第です。 私まだ大きな誤解をしていますか？ それについてもgor522::Tn10(Tcr)の意味を正しく理解すれば分かるということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1741-15 - 2009/12/16 (水) 10:55:32 - おお gor522::Tn10(Tcr)この意味をよく調べて勉強すればいいかと思います。 努力家のようなので、きっと納得できるようになると 思えます。よく調べているようですが、もう一息です。

(無題) 削除/引用 No.1741-14 - 2009/12/16 (水) 10:37:21 - りこんびなんと 揚げ足ばかり取っているようですみません。 ですが、これを機会に今後のためにもきちんと理解しておきたくて・・・・・ マニュアルには Rosetta-gami 2(DE3)pLysS（正確にはこの株です） Δ( ara–leu)7697 ΔlacX74 ΔphoA PvuII phoR araD139 ahpC galE galK rpsL (DE3) F’[lac+ lacI q pro] gor522::Tn10 trxB pLysSRARE2 (CamR, StrR, TetR) と記載されており、ecoli様のおっしゃる通りこれでは分かりませんでしたので ググってみました。 自分なりに精一杯探してみたのですがどうしても見つからず その代わりメーカーの別ページに The gor mutation is selectable on tetracycline. との記載をみつけました。 これはやはりテトラサイクリンを加えないとgor mutationが落ちてしまうということにはならないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1741-13 - 2009/12/16 (水) 10:10:00 - おお >[Re:12] さくさんは書きました : > おお様 > 元々ほとんど不溶画分に行くタンパク質だったんです。効率は良くないものリフォールディングして使えそうだったので、発現量だけ稼ぎたかったのです。コドンを合わせて可溶化した訳でもなく…。 > 色々なメーカーで遺伝子合成をやっていますが、設計に使うソフトでも違うのかな、と思っていたりします。RNAの二次構造なんかも計算するそうですので。 ありがとうございました。不溶画分に行くのは発現量が多いから という考えもありますのでトータルで量が増えていても、 不溶画分に取られてしまっているとではとちょっと思っていたわけです。 なかなか微妙みたいですねコドンを合わせても、、、

(無題) 削除/引用 No.1741-12 - 2009/12/16 (水) 10:02:07 - さく おお様 元々ほとんど不溶画分に行くタンパク質だったんです。効率は良くないものリフォールディングして使えそうだったので、発現量だけ稼ぎたかったのです。コドンを合わせて可溶化した訳でもなく…。 色々なメーカーで遺伝子合成をやっていますが、設計に使うソフトでも違うのかな、と思っていたりします。RNAの二次構造なんかも計算するそうですので。

(無題) 削除/引用 No.1741-11 - 2009/12/16 (水) 09:22:52 - おお >[Re:10] さくさんは書きました : > 某社にて大腸菌のコドンに合わせて遺伝子合成をしてもらい、普通にクローニングしたものと横並びで発現させたら、遺伝子合成の方が発現が低かったという経験もあります。 > コドンを合わせたら、発現量は上がるか、最低でも同じぐらいになるもんだと勝手に思いこんでいたので哀しかったです…。 > 元々CBBで見える位は発現できるタンパク質だったのですが。 便乗ですが、興味があります。これは不溶画分にいってしまった ていうことはありませんか?

(無題) 削除/引用 No.1741-10 - 2009/12/15 (火) 18:19:25 - さく 某社にて大腸菌のコドンに合わせて遺伝子合成をしてもらい、普通にクローニングしたものと横並びで発現させたら、遺伝子合成の方が発現が低かったという経験もあります。 コドンを合わせたら、発現量は上がるか、最低でも同じぐらいになるもんだと勝手に思いこんでいたので哀しかったです…。 元々CBBで見える位は発現できるタンパク質だったのですが。 こんなこともあったよ、ということで。

(無題) 削除/引用 No.1741-9 - 2009/12/15 (火) 16:40:35 - ecoli メルクかnovagenの説明書にロゼッタガミの遺伝子型が載っていると 思います．gor522::Tn10(Tcr)っていうのがあると思いますが、 ゲノム上のgor遺伝子がテトラサイクリン耐性遺伝子の乗っかった トランスポゾンTn10によってつぶれていますっていう意味です． ただ、オリガミとかロゼッタガミの遺伝子型の記述は親切でなかった 気もするので、ググルといいかもしれないです． 後半の質問に関してはよろしいです． ただ、腸管さんの言うような現象もあるようなので、 濃度とかも含めて検討するといいかもです． ちなみにハマりそうなタンパクなら、 遺伝子合成した方がお得だと思います． 10万くらいで大腸菌用のcodon usageに変えた遺伝子をpET系に 組み込んでくれるサービスがあります． ロゼッタガミでうまくいかないタンパクも最適化してやると 普通にBL21DE3でガンガン発現するので超おススメです． 今まで10個くらいの遺伝子について外注しましたが、 発現しなかったことはないです．

トピ主です。 削除/引用 No.1741-8 - 2009/12/15 (火) 05:10:05 - りこんびなんと お返事が遅くなりまして申し訳ありませんでした。 また、お返事をいただきました皆様、本当にありがとうございました。 もう１点だけ分からないところがあるのですが ecoli様のおっしゃる 「ロゼッタガミの場合、ゲノム上のグルタチオンレダクターゼ をつぶしてるのがtetなのでテトラサイクリンもいらないです」 というのはどのようにして分かるのでしょうか？ 今後の参考のためにもマニュアルのどの部分、もしくは 「・・・」という表記よりというところを教えていただけませんでしょうか？ テトラサイクリンやストレプトマイシンを加えなくても レアコドンをエンハンスするプラスミド及び trxB/gorミューテーションは落ちないという解釈でよろしいのですよね？

(無題) 削除/引用 No.1741-7 - 2009/12/14 (月) 16:05:57 - 腸管 私もecoliさんと同様にロゼッタガミBを使用しています。 他の方々が書かれているように、 大腸菌からのプラスミド落ちを防ぐ目的で 抗生物質を加えています。 なので、クロラムフェニコールとアンピシリン（pETのため）を加えて 培養しています。 ただ、不溶性にタンパクが行き過ぎている時 低温誘導などしても改善されなければ テトラサイクリン・カナマイシンも加えて 育ちにくい（？）状況にしてやり 改善したこともありました。 あと、寒天培地にコロニーを形成させる時は クロラムフェニコール・テトラサイクリン・カナマイシン・アンピシリン の全てを加えていました。

(無題) 削除/引用 No.1741-6 - 2009/12/11 (金) 15:03:39 - ecoli 大腸菌rpsLはおおさんが言うようにゲノム上の リボソーマルタンパクの変異です． 大腸菌の遺伝子工学上伝統的な変異です． 通常薬剤耐性で遺伝子破壊をしている場合、 大腸菌では通常その薬剤を入れません． その変異が元に戻る可能性が非常に低いからです． よって、ロゼッタガミの場合、ゲノム上のグルタチオンレダクターゼ をつぶしてるのがtetなのでテトラサイクリンもいらないです． マニュアルには15μg/mLものテトラサイクリンを加えるように 書いてありますが、私の場合ロゼッタガミBですが、 テトラサイクリンを除いた方が、生育がよく、 タンパクの回収量も10倍程度良くなりました．

(無題) 削除/引用 No.1741-5 - 2009/12/11 (金) 09:24:06 - おお streptomycin is not necessary to maintain strain genotype. このフレーズをそのままうのみにして良いのではと おもいますが、、、、 ストレプトマイシンはたぶん大腸菌のクロモソームのrpsLに 変異が入っているとかの理由でストレプトマイシンを除いても ストレプトマイシン耐性がなくなったり、同時になにかプラスミドが 抜け落ちて、機能の一部が失われることがないという解釈 なんだと思います。

(無題) 削除/引用 No.1741-4 - 2009/12/11 (金) 09:17:18 - in situ それほど遺伝子工学は得意ではないのですが。。 通常、薬剤耐性は大腸菌のゲノム自体をいじるというよりは、プラスミドによって付加されていると思います。 ですので、プラスミド落ちを防止するために薬剤を加え続ける必要がある、と。 しかし、お示しの文章中には Rosetta-gami2はribosomal proteinにmutationを入れることでストレプトマイシン耐性にしている と書かれています。 つまり、通常の薬剤耐性のように、薬剤分解遺伝子を導入しているわけではなく、ゲノムをいじって薬剤が効かなくしているようです。 ですから、あえてストレプトマイシンを加えなくてもこの性質は脱落しませんよ、ということだと解釈しました。 ここらへん、専門ではないので、間違っていたらご指摘ください。

？？ 削除/引用 No.1741-3 - 2009/12/11 (金) 09:05:15 - りこんびなんと とおりがかり様 ご回答いただきましてありがとうございました。 ですが、やっぱり意味が分からないのです。 もう少しご説明いただけませんか？ 私が使っているホストはRosetta-gami2に間違いはないです。 そしてストレプトマイシンに対する耐性も持っています。 Rosetta-gami2をホストとしてタンパク質発現をする際の培養にはストレプトマイシンを加える必要はないということでしょうか？ では、どのような場合にストレプトマイシンを加えなければならないのでしょうか？ それとも、ただ単に耐性を持っていると言うか持ってしまっているというだけの話で どんな場合にもまったく加えなくて良いということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1741-2 - 2009/12/11 (金) 07:06:15 - とおりがかり 文字通りだと、この耐性はストレプトマイシンが変異rpsLにターゲットできないことによるのであなたが培養しているものがRosetta-gami2であるならばストレプトマイシンは必要はないですね。

Rosetta-gami2の抗生剤 削除/引用 No.1741-1 - 2009/12/11 (金) 06:08:12 - りこんびなんと あるタンパク質を大腸菌内で発現させるために宿主細胞としてRosetta-gami2を用いました。 プラスミドベクターがアンピシリン耐性であることと、上記Rosetta-gami2の細胞がクロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン耐性であることから 大量培養の前培養には4種類すべてを培地に加えています。 ただ、細胞のマニュアルには下記の文章が載っていました。 These strains carry a mutation in ribosomal protein (rpsL) conferring resistance to streptomycin; therefore streptomycin is not necessary to maintain strain genotype. はっきりと理解が出来ないのでどなたか教えて下さい。 これはつまりどんな場合にはストレプトマイシンを加えなくても良くて どんな場合には加えないといけないのですか？

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