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解決しました! 削除/引用 No.1739-11 - 2009/12/23 (水) 00:42:58 - tamama これまでの経過から、ベクター側に問題があると考えられていたため、�@intactのpMXsベクターの調製、�A制限酵素消化およびゲルでのstuffer配列の除去、�Bアダプター付加cDNAとベクターとのライゲーション、�CDH10Bへの形質転換後の培養、の各ステップについて再度検討しました。 その結果、�Aのライゲーションの際、これまでTaKaRa Ligation Mixを用いていたのですが、反応系でのDNA濃度を下げ、PEGを含まない反応条件でライゲーションしたところ、ベクターの削れたクローンが見られなくなりました。 ベクターのみでライゲーション反応を行い（Ligation Mix使用）、形質転換したDH10Bをプレート培養し、生育したクローンのインサートを調べたところ、セルフライゲーションでも切れ残りでもないクローンが主であったことからも、このステップがクリティカルに効いていたと考えられます。 PEGの働きによりDNAがcrowdedな環境下におかれ、ミスマッチライゲーションが起こりやすくなっていたことが原因なのではないかと考えられます。 今回の件は非常に勉強になりました。 ご意見をくださった皆さんに心から感謝致します。

経過報告 削除/引用 No.1739-10 - 2009/12/17 (木) 22:14:38 - tamama 皆さんにご意見いただき、ベクターとインサートのライゲーション後の培養（1時間の液体培養およびその後のプレート培養）を30℃にしてみました。 インサートの切り出しおよびインサート部位を含む配列のPCRにより、12個のクローンのインサートをチェックしたところ、やはりベクターが削れてしまったクローンが多く認められました。 インサートにはアダプターを付加したcDNAのほか、制限酵素サイトを含むプライマーでのPCR産物の酵素消化物や、他のベクターから切り出したDNA断片も用いてみましたが、どちらも非常に挿入率が悪かったため（5分の１程度）、ベクター側に問題があると考えられます。 ウイルスベクター安定株の調達が難しそうなので、とりあえず、ベクターおよびcDNAの調製からやり直し、再度低温培養を試してみる予定です。何かアドバイスありましたら宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1739-9 - 2009/12/12 (土) 18:33:02 - tamama wizさん＞ ご返答ありがとうございます。 関連トピは沢山あるようですね･･･お手数かけてすみませんでした。 結果が出次第、こちらに報告させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.1739-8 - 2009/12/12 (土) 16:16:05 - wiz 私の経験では、確かpMXsはintactな状態では削れるようなことは無かったと記憶しています。何かインサートが入ると、組換えを起こしているのか短くなることがありました。 ですので、intactなplasmidであれば37℃でかまわないと思います。 過去トピについて、例えば ttp://www.kenkyuu.net/cgi-biotech/biotechforum.cgi?mode=view;start=2;Code=3172 このほかにもいくつかあったと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.1739-7 - 2009/12/12 (土) 14:56:09 - tamama 返答が遅くなりすみません。皆さんご意見ありがとうございます。 DH10BはinvitrogenまたはNEBのコンピタントセルを用いています。インサートチェックに自作のものを用いていますが、これは問題ではないですよね？DH10BはpMXsで繁用されている株らしいので、ホストの問題ではないと思います。とりあえずは培養温度を30℃にするというのを試してみたいと思います。 wizさん＞「形質転換後の大腸菌培養温度を30℃にすることで･･･」とありますが、切断などをしていないintactのベクターの場合でも、形質転換後の温度を下げる必要はありますか？また、過去トピを検索しても該当トピを見つけられなかったので、参照トピを教えていただけると嬉しいです。

(無題) 削除/引用 No.1739-5 - 2009/12/11 (金) 10:17:37 - wiz 使ったコンピテントセルはDH10Bではないですが、pMX関係のplasmidで似たような経験があります。やっかいですよね。。 過去トピにもありましたが、私の場合は形質転換後の大腸菌培養温度を30℃にすることで劇的に改善されました。菌株を変えるのも手だと思いますけれど、とりあえず低温で培養してみてはいかがですか？

(無題) 削除/引用 No.1739-4 - 2009/12/11 (金) 02:16:03 - モモ あ、でも、今いるラボでは普通にXL1−BlueやDH10Bでレンチを増やしてますが、特に問題ないみたいです。

(無題) 削除/引用 No.1739-3 - 2009/12/11 (金) 01:52:51 - モモ 真偽のほどは私にはわかりませんが、LTRの組み換えの話は聞いたことがあります。それで、わたしが前にいたラボではSTBL2というコンピタントセルを使っていました。

(無題) 削除/引用 No.1739-2 - 2009/12/11 (金) 01:16:15 - MDS ちゃんと調べてませんので、寝言と思ってください。 DH10BってDH10Bacのことですか？ これって普通のプラスミド（ウイルスベクターも含む）のコンピとしても使えるんでしたっけ？

レトロウイルスベクターが削れてしまう 削除/引用 No.1739-1 - 2009/12/10 (木) 22:45:49 - tamama 現在レトロウイルスベクター(pMXs)を用いて発現クローニング用のcDNAライブラリーの作製を試みています。 譲与していただいたベクターをXL1-blueで増やし、BstXIまたはEcoRIで切断、アルカリホスファターゼ処理した後、各制限酵素部位のアダプターをライゲーションさせたcDNAをライゲーションしました。このDNAをDH10Bに導入し、配列を確認したところ、ベクターが削れて読めなくなっているクローンが多数みられました。cDNAのアダプター付加は確認しました。制限酵素、アルカリホスファターゼのロット（メーカー）を変えても改善されませんでした。 レトロウイルスでは、LTRで組換えが起こりうると聞いたことがあるのですが、それが原因なのでしょうか？また、この削れを防ぐにはどうしたらよいのでしょうか？

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