全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1732-5 - 2009/12/12 (土) 08:28:59 - おお ありがとうございました。 >[Re:4] Real-timeさんは書きました : > RNAは、ミスアニーリングを起こす可能性のある配列が細胞により変動し、同じプライマーを用いてもPCRの難易度が細胞ごとに変わる印象が大きいです。 全く同じように感じています.

(無題) 削除/引用 No.1732-4 - 2009/12/11 (金) 11:33:34 - Real-time 最近同じプライマーで、ゲノムDNAとcDNAの同じ領域を増幅しました。ゲノムDNAから増幅可能にするにはDMSOが必要でしたが、cDNAでは必要ありませんでした。もっとも、コピー数の比較などはしておりませんので、大幅にコピー数が異なっているかもしれませんが、ゲノムとcDNAではプライマー配列が含まれている配列の長さが異なり、これが変性のしにくさに影響を及ぼしているかもと感じております。 RNAは、ミスアニーリングを起こす可能性のある配列が細胞により変動し、同じプライマーを用いてもPCRの難易度が細胞ごとに変わる印象が大きいです。もっとも、おお様もご存知のとおり、抗体を用いるウエスタンやIHCではRT-PCR以上の大規模かつ不可避の組織による難易度の変動があるため、私には”核酸はいじくっていれば何とかなる”印象が強いです。 蛋白も目的蛋白だけPCRのように簡単に増やせる方法があればいいのですが、私は未だに見つけておりません。ご存知の方いましたら教えてください。

(無題) 削除/引用 No.1732-3 - 2009/12/10 (木) 06:48:07 - おお >[Re:2] Real-timeさんは書きました : > RNAは逆転写効率、RNAの品質、RTprimerやWhole Transcriptomeに占めるターゲットの割合などの影響を受けるため、サンプルごとにPCRの難度が大きく変わります。 ありがとうございました。cDNAから考えるとgDNAよりはよく増える というご経験があるということですね。 ご指摘のようにRNAからの逆転写の効率とかありますし、鋳型に 依存する要素もありますので物によって全然ちがうだろうな とは思っていましたし、ご経験が豊富な方ほど答えようがない 質問になってますね。 難易度ということですが、RTPCRでかからないこともあるので 条件を探っていらっしゃるということでしょうか、、、 それとも改善してgDNAとかとくらべてそん色ない程度まで 持っていっているということでしょうか、、、 なんかいろいろ妄想しながら質問してますが、お時間があれば で結構ですので、関連することで何かあればよろしければ またお立ち寄りください。

(無題) 削除/引用 No.1732-2 - 2009/12/10 (木) 06:20:02 - Real-time おお様 いつも的確なコメントを見せていただきありがとうございます。 コピー数が同じかどうかは確かめていませんが、同じプライマーを使ってｃDNAとgDNAの同じ配列を増幅しています。あくまで個人的な印象ですが、gDNAの場合、変性剤を入れたり、Denatureを長くしたりしないと増えないことがあり、cDNAのほうが、どちらかというと増えやすい印象があります。私の場合、RNAseH処理後のssDNAをRT-PCRの鋳型にしているため、余計そう感じるのかもしれません。エキストラバンドもgDNAの方が心もち多めでした。RNAは逆転写効率、RNAの品質、RTprimerやWhole Transcriptomeに占めるターゲットの割合などの影響を受けるため、サンプルごとにPCRの難度が大きく変わります。

(ds)DNAとRNA(mRNAなど)の(RT-)PCRの検出感度の違い。 削除/引用 No.1732-1 - 2009/12/10 (木) 04:32:00 - おお 同じ濃度(分子の数)のターゲットの配列をもったDNAとRNAがあるとします。 そのDNAをPCRで、またRNAをRT-PCRで検出したとき、 シグナル/分子の数という観点でどれくらい検出感度 に違いがあるか、プラクティカルに実感のあるかた、 あるいは比べたことがある方はいますでしょうか?

全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---