Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

最新のフォーラム　|　このフォーラム　|　ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

細胞増殖ELISA,BrdUでのトラブル トピック削除
No.1730-TOPIC - 2009/12/09 (水) 23:07:53 - JLBAPN
Rat Primary hepatocyteを用いてある薬剤によって誘導される細胞増殖を細胞増殖ELISA,BrdU発色キット(Roche、ttp://app.roche-biochem.jp/catalog/index.php/product_3.5.3.21.1.8/category_33586.html)を用いて行っています。
問題は最後のステップで反応を停止するために硫酸を加えるのですが、これをやると溶液が均一にならずにムラというかダマらしきモノが観察されます。取説に従い、数分agitationしても解決しませんでした。そこで反応停止を行わずに測定してしまうと測定誤差が非常に大きくなり、やはり反応停止の必要性を感じていますが、前述の問題が解決していないので困っています。
どなたか（反応停止後の問題）解決の糸口をご教示頂けないでしょうか、よろしくお願いします。

また、下記に簡潔ではありますがプロトコールを記載します。
１．細胞播種３時間後に、薬剤とBrdUを添加し22時間インキュベート。
２．上清を除去して、FixDenat試薬を添加して細胞の固定とDNAの変性を同時に行う。
３．POD標識抗BrdU抗体を加え，最後にPODの基質を加え，硫酸で反応停止後、発色産物の吸光度をELISAリーダーで測定。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全2件 ( 1 〜 2 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.1730-2 - 2009/12/11 (金) 11:17:34 - DC
おそらく、そのキットの反応限界以上に、酵素量が多すぎる（細胞が増殖しすぎている）のだと思います。
スタンダードと比較しての検出限界を超えている、というよりは酵素反応としての限界が超えているという意味です。

サンプル量が多すぎるウェルは停止液を入れると、毛みたいのが出てきて汚らしくなります。
そしてそのようになってしまったウェルは吸光度もバラバラで信頼性がありません。

だから、最初の蒔き込み細胞数を減らすか、増殖刺激を減らすかした方がいいと思いますよ。

細胞増殖ELISA,BrdUでのトラブル 削除/引用
No.1730-1 - 2009/12/09 (水) 23:07:53 - JLBAPN
Rat Primary hepatocyteを用いてある薬剤によって誘導される細胞増殖を細胞増殖ELISA,BrdU発色キット(Roche、ttp://app.roche-biochem.jp/catalog/index.php/product_3.5.3.21.1.8/category_33586.html)を用いて行っています。
問題は最後のステップで反応を停止するために硫酸を加えるのですが、これをやると溶液が均一にならずにムラというかダマらしきモノが観察されます。取説に従い、数分agitationしても解決しませんでした。そこで反応停止を行わずに測定してしまうと測定誤差が非常に大きくなり、やはり反応停止の必要性を感じていますが、前述の問題が解決していないので困っています。
どなたか（反応停止後の問題）解決の糸口をご教示頂けないでしょうか、よろしくお願いします。

また、下記に簡潔ではありますがプロトコールを記載します。
１．細胞播種３時間後に、薬剤とBrdUを添加し22時間インキュベート。
２．上清を除去して、FixDenat試薬を添加して細胞の固定とDNAの変性を同時に行う。
３．POD標識抗BrdU抗体を加え，最後にPODの基質を加え，硫酸で反応停止後、発色産物の吸光度をELISAリーダーで測定。
全2件 ( 1 〜 2 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を