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(無題) 削除/引用 No.173-11 - 2009/08/27 (木) 11:11:44 - う 同じようにやっているつもりでも 同じようにやっていないから出来ていないわけで。 プロトコールは貼付けてどうですかと言われても それって教えてもらったプロトコールでしょう？ ここで質問するよりも、 実際の作業で自分との違いを事細かに見つけ出してやる！！！！！ くらいの気概で教えてもらうなり、 手を動かすなりしないと解決しないと思います。

(無題) 削除/引用 No.173-10 - 2009/08/27 (木) 10:18:22 - IHC WashはうちではPBS-Triton(3%)でやってるけどね。

(無題) 削除/引用 No.173-9 - 2009/03/12 (木) 21:37:25 - CJ 前も書きましたが、複数の問題が存在するようなので、ひとつずつ切り分けていきましょう。 １．脳の固定は大丈夫？ ２．手技の問題？ ３．抗体は大丈夫？ ４．共焦点の操作は大丈夫？ １．は先輩の切片をもらって実験すればよいでしょう。 ２．はまったく同じ条件で先輩と一緒に実験するとか。 ３．はウサギ抗体がよいのかはわからんので、マウス抗体のみに絞って実験するなど。もし明視野染色もするラボでしたら、いちどABC法で染めてみてうまくいくのか確認するのも手です。 ４．が一番怪しいような気がするのですが…。油浸レンズで油をつけてないとか、その手のミスでシグナルは劇的に低下しますし、像はぼやけます。

(無題) 削除/引用 No.173-8 - 2009/03/12 (木) 16:22:07 - 免染初心者 >>りょう　様 言葉足らずで申し訳ありません。 おっしゃるとおり、rabbitの抗体は新規に購入したもので、研究室の誰も使ったことがありません。 mouseのほうは以前から研究室にあった抗体で別の人が染めたとき(マウス脳で同じステージのもの)には染まりました。 ただ、私が染めたときはどちらも染まっていません。どちらもシグナルが低く全体的にぼんやりとした感じでした。

(無題) 削除/引用 No.173-7 - 2009/03/11 (水) 22:09:40 - りょう rabbitの抗体は先輩も試したことないということでしょうか？ mouse抗体のシグナルが正確に得られているのなら、 単にrabbit抗体が免疫染色に使用できないだけですよね。

(無題) 削除/引用 No.173-6 - 2009/03/11 (水) 21:58:39 - 免染初心者 お返事ありがとうございます。 >>りょう　様 実は今回も先輩に、実験台が隣り合わせなので付きっ切りではないのですが、見てもらいながらやりました。 先輩も何でうまくいかなかったのかわからないとのことで、明日またちゃんと見てもらえるようお願いしました。 >>〜　様 参考になるご意見ありがとうございます。 共焦点もまだ慣れていないので不安なところではあります（汗 プロトコルですがブロッキングについて抜けていました。（こぴぺした時に潰したようです（恥 正しくは、 PBS wash　10min　RT x5 ↓ 0.5% Triton X100/PBS 30min RT ↓ PBS wash 10min RT ↓ blocking 5%馬血清/0.3% Triton X100/PBS 30min RT ↓ 一次抗体反応　4℃　over night ↓ PBS wash 10min RT ↓ PBS wash 15min RT x2 ↓ 二次抗体反応　RT 2hours ↓ PBS wash 10min RT ↓ PBS wash 15min RT x2 ↓ 封入・共焦点顕微鏡で撮影 となります。 1次抗体はrabbitのものとmouseのものを使って二重染色をしています。 rabbitの抗体のほうは新しく買ってみた抗体でちゃんと染まるかはまだわかりません。（メーカーのリファレンスは脳の論文ではなかったため） mouseのほうはちゃんと染まることが確認できています。

(無題) 削除/引用 No.173-5 - 2009/03/11 (水) 21:44:37 - CJ １次抗体及び２次抗体液に正常血清が入っていればブロッキングの効果があると思いますが、ここに書いてある条件だけじゃあわからないですね。 それ以外の点でプロトコルはきわめて標準的です。 まず切り分けるべきは「免疫染色がうまくいかない」のか「コンフォーカルの操作がおかしい」のどちらが問題なのか、というところでしょうね。 やはり他の方もおっしゃっているようにうまくいっている先輩に見てもらうのが一番ですかね。

プロトコルは本当にこれでOK? 削除/引用 No.173-4 - 2009/03/11 (水) 21:22:31 - ~ そういえば、正常血清などでのブロッキングはしなくて大丈夫なのですか？ 抗体や条件によっては要らないのかもしれませんが、 のっぺりしていると言うことは、非特異だらけになっているのが うまくいっていない原因でもおかしくありませんよね。

(無題) 削除/引用 No.173-3 - 2009/03/11 (水) 21:12:58 - ~ 実は共焦点の設定を間違えているだけと言うことはありませんよね。 試薬の希釈濃度などを間違えていなければ、 先輩の操作を見るのが一番だと思います。 可能であれば隣で一緒に操作しましょう。 ○先輩が固定して切った切片 ○貴方が固定してきった切片 を隣で一緒に操作すれば、貴方の固定などに問題が無いかも見ておきましょう。 抗体が混ざっていない 洗浄のバッファーが十分量でない 攪拌、振倒などがうまくいっていない 切片が乾燥した 封入剤を間違えた などは思いつきはしますが、そんな書き込みをいちいち気にするよりも、 出来ている先輩の指先を見た方が参考になると思います。

(無題) 削除/引用 No.173-2 - 2009/03/11 (水) 19:30:37 - りょう その先輩に横で見てもらうのがベストです。

免疫染色がうまく行きません 削除/引用 No.173-1 - 2009/03/11 (水) 18:19:42 - 免染初心者 マウスの脳のスライスを免疫染色しようとしています。 固定はは固定液(4%PFA/PB)で灌流固定した後に脳を取り出して１晩固定液につけた後、３０％スクロース水溶液で置換しています。 切片はOCTコンパウンドを使って固めたものを１２μｍでスライスにしています。 染色の手順としては、 PBS wash　10min　RT x5 ↓ 0.5% Triton X100/PBS 30min RT ↓ PBS wash 10min RT ↓ 一次抗体反応　4℃　over night ↓ PBS wash 10min RT ↓ PBS wash 15min RT x2 ↓ 二次抗体反応　RT 2hours ↓ PBS wash 10min RT ↓ PBS wash 15min RT x2 ↓ 封入・共焦点顕微鏡で撮影 という手順でやっているのですが、共焦点で見ると全体的にシグナルが弱くのっぺりした感じになってしまいます。 同じ手順でやっている先輩はうまくできているので私の手技的な問題だと思います。 ただ、どういった点でミスをしているのかが思い当たらないので、些細なことでも結構です、思い当たるところがございましたらご指摘いただけないでしょうか？ よろしくお願いします。

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