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(無題) 削除/引用 No.1729-7 - 2009/12/11 (金) 07:10:56 - おお 小出しですいません。濃縮ですが、場合によっては免疫沈降 が使えると思います(総タンパクを濃縮しているわけではありませんけど)。

(無題) 削除/引用 No.1729-6 - 2009/12/10 (木) 10:31:07 - おお 濃縮よりも付着した細胞であればトリプシンを使わず PBS-EDTAをつかってスクレーパーとかで書き取って 遠心して回収したペレット(細胞)を適切な容量の バッファーにけんだくすればいいと思います (トリプシン使う人もいるようですけどね)。 バイチ成分の濃縮でしたら硫安だと沈殿しない タンパクもそれなりにあるかもしれません。 バイチはあまり解析しないのでなんともいえませんが TCAはメタノール-クロロフォルム法で沈殿して 濃縮できるかもしれません(あまりタンパク濃度が うすいとロスが大きいかもしれませんが)。 ただ血清のはいったバイチだと大量にBSAがありますので バイチそのまま流しても解像度を考えると サイズによってはのせすぎで結構厳しいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1729-5 - 2009/12/10 (木) 10:01:42 - もこもこ いろいろなコメントありがとうございます。 実際の研究では培養視細胞からロドプシン蛋白の発現を調べようと考えています。免染による研究は別に進めているのですが、訳あって途中で出来なくなる可能性もありウェスタンも同時進行で考えています。 ロドプシンは細胞内発現タンパクであるので出来れば培地中への分泌蛋白とは別に分析したいと考えています。なので培地吸引後に付着細胞のみに働きかける操作があればと思います。 扱っている細胞は存在数が多くないため、回収後の濃縮方法などもご存じの方がいましたらよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1729-4 - 2009/12/10 (木) 09:10:53 - 低分子 1633に書いたものです。 私はNP-40バッファーを使っています。（核タンパクには適さない場合があります） http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1633

(無題) 削除/引用 No.1729-3 - 2009/12/10 (木) 06:53:31 - おお あ、バイチ中のタンパクも解析したいのでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1729-2 - 2009/12/10 (木) 01:49:56 - おお 人それぞれ、実験によって違いますから方法はたくさんあります。 一番手っ取り早い方法は、シャーレに張り付いている細胞であれば、 PBSで洗って、SDSPAGE用のサンプルバッファーを直接かけて、 タンパクを溶出できます。このときゲノムも溶出してきますので ねんちょうな溶液になりますから、注射ばりを通して扱いやすく するか、超音波処理をして同様に扱いやすい状態にすることが おおいです。色素入りのバッファーを使うとタンパク定量 がしにくくなりますので色素(BPBなど)の入っていないサンプル バッファーを使う人もいるかと思います。 なん点は夾雑物が多くなりエイどうバターンが理想的な状態より 汚くなることがおおいです。 ディシュをあらい、そのごTCA(たしか5-10%くらい)でディシュ にタンパクを固定後、冷エタノールで洗浄して、サンプルバッファー で溶解する方法もあります。こちらのほうがサンプルバッファー で直接溶解するより夾雑物が少なく、きれいにえいどうできる とおもいます。 PBSで洗って直接TRITONを含むバッファーで溶解してもいいかと 思います。生理的な塩濃度のバッファ-を使い溶出すると クロマチン、核マトリクスは完全に溶出できませんので ねんちょうになる事はないです。塩濃度を300mM以上にすると クロマチンの構造もほぐれてきて、溶出力は幾らか高くなりますが ねんちょうになってきます。その後は硫安などの処理 はせずにサンプルバッファーを加えエイどうできます。 サンタクルーズとか抗体メーカーなどはその辺のプロトコール を提供していますし、数社のカタログ、ウェブページで プロトコールを比較、確認されるといいかと思います。 たいていマイルドなデタージェント入りのバッファーでの 溶出方法が記載されていると思います(IPができるように 考慮されているからだとおもいますが)。

細胞のウェスタン 削除/引用 No.1729-1 - 2009/12/09 (水) 22:10:07 - もこもこ 現在細胞培養をしているのですが、細胞からのウェスタンブロット法の詳細を知っている方がいらしたらお教えいただけないでしょうか？ 培養細胞は付着性で、ラミニンやコラーゲンコートdish(35mm)で培養しております。目的タンパクに対する一次抗体は所有しているので、自分なりに考えた戦略としては �@培養細胞をﾄﾘﾌﾟｼﾝなどでdishから剥がす �ATritonなどで可溶化し細胞内成分を放出させる �B培地を回収し遠心や硫安などで濃縮する �C回収溶液をSDS-PAGE用のサンプルとして起用する という流れを想定しているのですが、一般的な方法はどのようなものなのでしょうか？細胞からのウェスタン用のキットなどは所有していないため、出来れば試薬など自分で調整して行なえる実験系が組めたらと考えています。ご存知の方がいましたらお願いします。

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