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(無題) 削除/引用 No.1725-5 - 2009/12/10 (木) 23:37:25 - TS 私は、組織中（肝臓、筋肉）グリコーゲンを測定するときは、決まってアンスロン硫酸法を使います。感度も申し分ないですし、信頼性の高い方法です。生化学実験法などの教科書を見れば載っていますよ。 もちろんtoyoさんが提案しているような酵素を用いる方法を含めて、他の方法もありだと思いますが、いくつか気になりました。 中和、キットでグルコースを測定というのは、一般的なのでしょうか？　NaOHの添加量は理論的な中和必要量を使用しているのですよね。pHってぶれないものなのでしょうか？　グルコース測定に影響が出そうな気が。 1-10 mgの組織。。。10mg未満の精秤が可能とはあまり思えません。誤差が大きくなっていませんか？ グリコーゲンは、分解活性が非常に高いですが、組織採取後、速やかに液体窒素、あるいはドライアイスによるアイスクランプでとうけつしていますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1725-4 - 2009/12/10 (木) 20:15:20 - Gly 皆様ご助言ありがとうございます。 まず、サンプルのphですが、NaOHとTrisも用いて調整しておりますのでそこまでのズレは無いとは思うのですが、今後の参考にさせて頂きます。 また抽出した1つのサンプルをtriplicateした場合は結果にサンプル間差はみられません。 この結果から筋サンプル自体のGlycogen量の差、あるいは抽出段階での差を疑っているところではあるのですが…。 酵素消化法による抽出法ですが、まだ試したことがありませんでしたので、ぜひ行ってみたいと思います。 抽出段階で誤差が生じている可能性も考えていたので、大変参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.1725-3 - 2009/12/10 (木) 17:07:49 - み 私も以前、硫酸による加水分解を行いましたが、食事下の肝臓と絶食下の肝臓とで差が認められなかったので、実験自体が上手く走っていないと判断しました。 そして以下の酵素消化法で上手く行きました。 homogenized in 3% (w/w) perchloric acid. the homogenate was incubated for 2 h at 40°C with amyloglucosidase. The resulting glucose residue was measured using an enzymatic glucose kit.

Re: 組織中のグリコーゲン定量 削除/引用 No.1725-2 - 2009/12/09 (水) 22:17:59 - toyo 私は培養細胞のglycogenをルーチンに測定していますが、 硫酸による加水分解の代わりに酵素で分解しています。 Sigma社のKitが何なのか知りませんが、ものによっては 検出反応がpHに大きく依存しているようですから、 中和後のpH等を気にしてみてはいかがでしょうか。 あとは、抽出した1つのサンプルについて、加水分解や測定を triplicateしてみてはいかがでしょうか。

組織中のグリコーゲン定量 削除/引用 No.1725-1 - 2009/12/09 (水) 20:53:03 - Ｇｌｙ 骨格筋内のグリコーゲンの定量を行っていますが、同一部位からのサンプルであってもサンプル間で値にかなりの誤差がでます。 1〜10mgの骨格筋(ヒト&マウス)から30%KOH/エタノール沈殿法を用いて抽出しています。沈殿後はH2SO4で加水分解し、NaOHを用いて中和した後に、SIGMA社のkitでGlucose濃度を吸光度測定の結果から算出しています。 同一部位の骨格筋であっても、1〜10mgのサンプル間でグリコーゲン量にある程度差があるものなのか、 あるいは実験系の中で誤差の要因となっている事象があるのかがわかりません。 どなたかご助言頂ければうれしく思います。

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