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(無題) 削除/引用 No.1713-12 - 2009/12/09 (水) 03:27:23 - c もし細胞がペレットで塊になった状態で可溶化液を入れて静置したということならそれはうまく溶けないように思います。ピペッティングとかホモジナイズとかで、細胞の塊を崩して細胞を液の中でできるだけ均一に分散させるひつようがあります。ただtritonだと核の構造はかなり維持されたままのこると思うので、仮に可溶化がうまく出来ても、沈殿（主に核蛋白質や細胞骨格が含まれる）もそれなりの量は出ると思います。対象の蛋白質の細胞内分布も考慮して抽出法や界面活性剤の選択を考える必要もあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1713-11 - 2009/12/08 (火) 20:48:49 - モモ 私も似たような実験を少しだけしたことがあります。 そのときはホモジナイズをしていました。 ホモジナイズなしとありでは、明らかにホモジナイズしたほうが 細胞が破壊されているように見えました。 ただ、遠心後に液層の上に何かが浮いていることがあり、フィルターを とおさないといけなくなることがあるのが難点です。 最近は面倒くさいので、液体窒素で一度凍結したあと氷水上で融解しただけでライセットを作っていますが、肉眼的にみるとホモジナイズありとなしの中間ぐらいの効果です。

(無題) 削除/引用 No.1713-10 - 2009/12/08 (火) 13:32:07 - おお どうしても10mL TRITON X100 1%二こだわりたいなら、 まず5mlでけんだくして、遠心して上澄みをキープして ペレットをもういちど残りの5mLで抽出すれば かなり抽出効率は変わると思います。

(無題) 削除/引用 No.1713-9 - 2009/12/08 (火) 13:28:39 - おお どうしても細胞が絶対に壊れたと思える処理をするのなら、 超音波とか、グラスビーズを入れてボルテックスとか、 あと凍結融解と言うのもあります。 でも通常はTRITONが1%もあれば細胞膜は溶解されます。 目的のものはペレットに来ているのでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1713-8 - 2009/12/08 (火) 13:25:10 - おお >[Re:5] 勉強不足さんは書きました : > おおさま　bostonさまアドバイスありがとうございます。 > > 私の書き方がいけませんでした、申し訳ありません。 > > > 実は細胞をトリプシンでdishから剥がしてPBSで洗った後、その大量のcell pelletに1 % Triton X 100を加えて、しばらくon iceにして、細胞膜を溶かすことを試みていたのですが、脱核のため強めに遠心すると、細胞が溶けていなかったのか、そっくりそのまま1 ml分のpelletができました。 1mlのペレットということは10cmのディッシュで30枚とか100枚くらいのスケールですよね、、、 バッファーは30mlとか必要な気がしますけど、、、、 実際はどれくらいのバッファーを使ったのでしょうか? > > その上清はとても澄んでいて、とても細胞内タンパクが出てきたとは思えません。 かようかしたタンパクは水に解けているからすんでいます。 1%TRITONでは核マトリクスを溶かすことができないので、 かなりの核が(核膜はようかいしているでしょうけど)ペレットが落ちてきます。 高い塩濃度をつかうと、クロマチンなども解離しますので 結構核内のたんぱく質も溶出してきます(核だけではないとおもいますが)。 hypotonicで処理しても見かけ的にはいっしょですよ。TRITON入れたよりも でてくるタンパクがすくないとおもいます。 トリプシン処理ごは血清などで活性を中和しているでしょうか? そうしないと処理によっては結構タンパクは分解されています (本題と関係ないですけど)。 > > そこで、1 % TritonXに入ったそのpelletをsonicationなどをすると細胞内タンパクが出てきたのか上清が濁りました。 > > > 試しに、もう一度生きている細胞をトリプシンで剥がし、トリプシンを中和した後、PBSでpelletで洗って、そのpelletに［水］を加えたところ、低張のため、速やかに細胞はパンクしました。 > > このような簡便な方法があるのなか、これで精製まで持って行けないかと考えています。 > > おおさんがお示しになられたbuffer組成と、水とでは全く異なりますが、なぜ、水ではいけないのか教えていただけませんでしょうか？ バッファーの基本的なコンセプトを思い出してください。 それ以外は カリウムはこの方法は核を取り出すのにもつかわれ、 カリウムのほうが核にやさしいからです。 DTTはアクシデンタルなSHの酸化によるアグリゲーション などを防いだリします。

(無題) 削除/引用 No.1713-7 - 2009/12/08 (火) 12:36:00 - ｙｔ 全大量が10mlにもなるのであれば、普通に10％ホモジネートを作る容量でホモジナイズしたらどうでしょうか？ 蛋白にもよると思いますが、蛋白の溶解度や構造の安定性に塩濃度が重要な場合もあるので、水だけというのはどうなんでしょうね？

(無題) 削除/引用 No.1713-6 - 2009/12/08 (火) 12:34:57 - in situ スレ主さんは『溶けない』というのを、タンパク質の可溶化に関して言っているのではなくてペレットがなくならないという意味で言っている気がします。 detergentを入れて溶解しても、多くの場合は、DNAを主体とした細胞のカスのようものがペレットとして残ります。 ですので、 ペレットが残る≠可溶化できていない です。 sonicationすると濁るのは、DNAがせん断されて細粒となり溶液中に拡散したせいでしょう。 可溶化の程度を知りたければ、細胞にそのままsample bufferを加えて溶かしたものと、上清を並べて流してみればよいと思います。 そのうえで、1% Triton-Xで溶けないのであれば、RIPAとかのちょっと強めの条件で可溶化を試みるとか。

(無題) 削除/引用 No.1713-5 - 2009/12/08 (火) 12:16:34 - 勉強不足 おおさま　bostonさまアドバイスありがとうございます。 私の書き方がいけませんでした、申し訳ありません。 実は細胞をトリプシンでdishから剥がしてPBSで洗った後、その大量のcell pelletに1 % Triton X 100を加えて、しばらくon iceにして、細胞膜を溶かすことを試みていたのですが、脱核のため強めに遠心すると、細胞が溶けていなかったのか、そっくりそのまま1 ml分のpelletができました。 その上清はとても澄んでいて、とても細胞内タンパクが出てきたとは思えません。 そこで、1 % TritonXに入ったそのpelletをsonicationなどをすると細胞内タンパクが出てきたのか上清が濁りました。 試しに、もう一度生きている細胞をトリプシンで剥がし、トリプシンを中和した後、PBSでpelletで洗って、そのpelletに［水］を加えたところ、低張のため、速やかに細胞はパンクしました。 このような簡便な方法があるのなか、これで精製まで持って行けないかと考えています。 おおさんがお示しになられたbuffer組成と、水とでは全く異なりますが、なぜ、水ではいけないのか教えていただけませんでしょうか？ 大変乱文で申し訳ありませんが、どうかご教示頂けますと幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1713-4 - 2009/12/08 (火) 11:54:39 - おお あ、そせいはプロトコールはいろいろあると思いますので絶対は ないですけど、 10mMHEPES pH8 1.5mM MgCl2 10mM KCl 0.5mM DTT とこんな感じです。 ばあいによっては0.1-0.3%ぐらいのトリトンX-100やNP-40を加えることがあります。

(無題) 削除/引用 No.1713-3 - 2009/12/08 (火) 11:49:52 - おお hypotonic bufferは低張な溶液で、浸透圧を利用して(細胞内より ていちょうなので、膜が膨れてきて破裂する) サイトゾルのたんぱく質をバッファーに放出 させる方法です。 したがってトリトンなどを使ったバッファーで溶出できなければ たぶんhypotonic bufferでは溶出しないとおもいます。 塩濃度を上げる(デタージェント存在下、非存在かで、500mMNaClくらいとか) にするのもてだと思います。あとはN-ラウロイルサルコシン酸は比較的 強いでタージェントですが、GST融合たんぱく質の精製の時に 使われることがあります。

(無題) 削除/引用 No.1713-2 - 2009/12/08 (火) 11:45:09 - Boston ソニケーションでも大丈夫だと思います。

細胞からのタンパク抽出に関して 削除/引用 No.1713-1 - 2009/12/08 (火) 11:21:20 - 勉強不足 お世話になります。 自分の勉強不足は否めないですが、みなさまのご意見を頂けますと幸いです。 現在、1ml分ものcell pelletから細胞内タンパクを抽出しようと試みています。 1% Triton X-100 in PBS 10 ml分で溶かしているのですが、なかなか細胞数が多すぎるのか溶けてくれません。 細胞内タンパクをnativeな状態でGSTタグを利用して精製してきたいため、変性剤など使用できません。 これほど多くのタンパクを効率的に細胞膜を破壊する方法としてdetergentを使わず、hypotonic bufferで溶かすのも手かと思います。 そこで皆様にお聞きしたいのは、この時のhypotonic bufferというのにはどういったものが使用されますでしょうか？ 素人的には［水］でもいいのかと思いますが、目的のタンパクがnativeな状態で精製されるか疑問です。 水でもいいのか、水ではいけない理由があるのか、他のhypo tonic bufferをするのはどういった理由なのか？など、どうかみなさまのご意見をいただけますと幸いです。

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