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(無題) 削除/引用 No.1703-8 - 2009/12/09 (水) 08:51:16 - masamune C源とN源をまとめてオートクレーブすると褐変します。 メイラード反応というやつです。 重金属はオートクレーブ後に加えるのがいいと思います。 Cdがどうだったかは覚えてませんが、モノによっては一緒にオートクレーブすると析出してしまった記憶があります。 見た目溶けていても、なんらかの複合体を作ってしまっている可能性が高いような気がします。

(無題) 削除/引用 No.1703-7 - 2009/12/08 (火) 16:33:03 - まさ 追加 菌株については、今回用いている菌と同じものでの論文もありましたので、おそらく問題はないと思います。

(無題) 削除/引用 No.1703-6 - 2009/12/08 (火) 16:30:38 - まさ 様々な意見ありがとうございます。 ちょっと自分なりに調べなおしてみたところ、原因となっている可能性のある部分がいくつか出てきました。 �@ガラクトースを培地に加えた状態でオートクレーブしていた。 酵母の研究室の先生に聞くと、糖は別に調整し後で加えているとのこと。 一緒にオートクレーブにかけると錯体を形成するとかなんとかかんとか・・・。 �ApHが中性から弱アルカリになっていた。 論文をもう少し読み解くと、ほとんどの論文でpHは弱酸性(pH5.5〜6位)でされていました。 これは重金属イオンの性質も変わってきそうなので可能性としてはかなり高いと思います。 培地が少しゆるくなると思うのですが、おそらく大丈夫とおもいます。 �B重金属を培地に加えた状態でオートクレーブしていた。 これはちょっとわからないですが、重金属イオンが培地の組成に何らかの影響を及ぼす可能性はないかなと思いました。 おそらくこれらのことがかかわっているのではないかと思うのですが、皆さんいかがでしょうか。 これは違う、またはこういう可能性はないかという意見がございましたらどうかお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1703-5 - 2009/12/08 (火) 01:35:27 - おお YCF1だけが重金属耐性にかかわっている訳ではないような気がしますので、 菌株によっては、その他の因子による依存性が高かったりするのでは ともおもえます。 実験としては同じ株を使うのがベストと思いますけどね、何かジェネッティック に相互作用するものを潰したバックグランドをもたせると さがでたりするのかなぁとも漠然と思います。 酵母の生育も通常1週間弱で見るでしょうけど、場合によっては 長期間培養でみたりとかもしますね。あとは培養温度とかいじったら 変わるかなぁって漠然とおもったり、、、

(無題) 削除/引用 No.1703-4 - 2009/12/07 (月) 15:25:14 - 弘法 重金属に対する感受性を調べたことがないので、一般論以上のコメントはできませんが、「論文と異なる点としては、菌株が違う」という一文に引っかかっています。お使いの菌株でもカドミウム感受性が観察されているという既報がありますか。 菌株に問題がないとすれば培地の問題だと思います。カドミウム感受性を調べている論文と同じ組成の培地をお使いですか。また、重金属を加えるのはオートクレーブ後にした方が無難だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1703-3 - 2009/12/07 (月) 10:07:36 - まさ ＞やまさま KO体は外国の研究者の方から送っていただいたものです。 これはその方の書いた論文にも使用されたものですので、信憑性は高いと思われます。 菌の系統については調べてみようと思います。 重金属をいれた培地は、ガラクトースを加えてからそのままオートクレーブしてもいいものなのでしょうか？ それとも、ガラクトースはオートクレーブ後に加えた方がいいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1703-2 - 2009/12/06 (日) 23:17:08 - やま 論文の株は何なのかわかりませんが 酵母では株間で結果が変わる事は結構あります。 本当に同じ系統かどうか確かめた方が良いと思います。 また、ノックアウトはご自分で作られたのでしょうか？ パーシャルディプロイドになっている可能性もあります。 作ったときにPCRによるチェックは行いましたでしょうか？ KOした遺伝子を挟む形の5'UTRと3'UTRのプライマーで確認しましたか？ パーシャルディプロイドですと、二本バンドが出ます。

酵母を用いたスクリーニングで論文通りの結果が出ない 削除/引用 No.1703-1 - 2009/12/06 (日) 21:47:18 - まさ いつもお世話になってます。 いま、カドミウムを加えた培地で酵母のスクリーニングを行っています。 重金属に感受性になるはずのKO体を用いてスクリーニングをかけてみたのですが、WTと感受性が全く変わらないという結果が出ました。 同じようなスクリーニングを行うとかなりセンシティブになるという論文はあります。 論文と異なる点としては、菌株が違う(しかし栄養要求性などは同じだから似たような株？)位だと思います。 ちなみに、おなじKO酵母を用いてヒ素を加えた培地でスクリーニングを行うとかなり感受性になったので、遺伝子のKOがうまくいっていないわけではなさそうです。 こういった場合、感受性とならない理由としてはどういったものが考えられるのでしょうか・・・。 皆さんの意見を聞かせてください。 お願いします。 ___________ 菌株：W303-1A KO遺伝子：YCF1(キレータータンパク−重金属複合体の液胞への輸送に関わる) 使用した試薬：CdSO4 , CdCl2 どちらを使っても同じような結果。 使用した培地:-ura培地、炭素源はガラクトース 酵母にはURA3を含むプラスミド(pYES)が導入されています。

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