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(無題) 削除/引用 No.1685-6 - 2009/12/06 (日) 20:59:07 - Q太郎 おおさん、正太さん ご返答ありがとうございます。 自分の勉強不足で見落としていましたが、プラスミド�@はColE1を持っていました。 ということは、pSC101oriをもつ706-Cre expression plasmidとプラスミド�@は共存できるということですね！ 706-Cre expression plasmidはテトラサイクリンおよびアンピシリン耐性です。 またCre plasmidのプロトコールには「Streak out the cells on L.B. plates containing 5 μg/ml of tetracycline (tet) plus ampicillin (amp; selection marker for the targeting plasmid).」とあります。 つまり、Cre plasmidとプラスミド�@（Amp耐性あり）のCo-transformationが起こった大腸菌がセレクションできるわけですね。 貴重なアドバイスありがとうございます！ コンピテントセルをプラスミド�@でtransformationさせた時のコロニーを再度コンピテントセルに変えて、Cre plasmidでtransformationできるか、試してみます。 また結果についてご報告します！

(無題) 削除/引用 No.1685-5 - 2009/12/06 (日) 19:40:43 - 正太 706-Creってtetのみじゃないですか？ プラスミド�@の大腸菌用のoriがpSC101由来でなければ、 いけると思う。 もし、706-Creがtetとampなら、プラスミド�@を持った大腸菌の コンピに706-Creを突っ込んでtetとampでセレクトすると、 いけるかもしんない。 おおさんの言うように無理な時は無理だけど、 基本toxicぢゃなきゃ落ちることは少ない。 tet、amp培地で飼うとプラスミド�@が落ちる可能性があるけど、 興味あるんで、ぜひ試して結果を教えてください。 Q太郎のケースとは違うけど、 私は4種類のプラスミドを同時に持たせたことがあります。 ampのプラスミドに乗ってる遺伝子がtoxicで、 培養24時間後には1/1000程度の細胞しか amp耐性を持っていなかったです。 ampのプラスミドはpBR系のoriでも、toxicだと とっても落としやすいイメージです。 ちなみにamp濃度を上げてもダメでした。

(無題) 削除/引用 No.1685-4 - 2009/12/06 (日) 09:42:35 - おお >[Re:3] Q太郎さんは書きました : > 706-Cre expression plasmidのoriは「pSC101ori」、プラスミド�@は「OriP」で異なるようです。 oriPはEB virusがマンマルの細胞で増えるためのoriでは、、、 大腸菌用のoriがほかにないですか、、、、 ColE 1/pMB1タイプのoriはpACYC、pSC101、R plasmidのタイプのoriと共存できるようです。 理論上大腸菌はそれぞれのタイプのoriをもつプラスミドを1つずつ維持できるので4種類の異なったoriをもつプラスミドを同時に維持できるようですが、、 もしかしたら記憶違いもあるかもしれませんので、モレキュラークローニング で詳しいことを確認してください。 > 薬剤とは抗生物質のことでしょうか？ > 706-Cre expression plasmidはテトラサイクリンおよびアンピシリン耐性、 > プラスミド�@はアンピシリン耐性ですが、これでは作成可能でしょうか？ 706-Cre expression plasmidにテトラサイクリンおよびアンピシリン耐性両方がのっていて大腸菌で発現するならそのコンビネーションで両方維持したままで増やすのは無理でしょう。

(無題) 削除/引用 No.1685-3 - 2009/12/05 (土) 22:22:16 - Q太郎 正太さん ご返答ありがとうございます。 ＞oriと薬剤が違えばできます． 706-Cre expression plasmidのoriは「pSC101ori」、プラスミド�@は「OriP」で異なるようです。 薬剤とは抗生物質のことでしょうか？ 706-Cre expression plasmidはテトラサイクリンおよびアンピシリン耐性、 プラスミド�@はアンピシリン耐性ですが、これでは作成可能でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1685-2 - 2009/12/04 (金) 19:37:35 - 正太 oriと薬剤が違えばできます．

プラスミドを持ったコンピテントセル作製 削除/引用 No.1685-1 - 2009/12/04 (金) 19:18:28 - Q太郎 Cre-loxP系を使った実験を計画しています。 CAGプロモーター下にloxPで挟まれたGFPとその下流に目的の遺伝子をインサートしたプラスミド（プラスミド�@とします）を作製しました。このプラスミドにCreを作用させGFPを切り出し、CAGプロモーター下に目的遺伝子を配置させ、目的のタンパクを発現させたいと考えております。その際、GENE BRIDGES社の706-Cre expression plasmidを使用しようと考えているのですが、この使用方法には、「706-Cre plasmid is transformed into an E.coli strain, which contains a targeting plasmid carrying a floxed selection marker」とあります。つまり、上記プラスミド�@を有した大腸菌にCre plasmidをトランスフォーメーションするのですが、そのためにはプラスミド�@を有した大腸菌をコンピテントな状態にする必要があります。このコンピテントセル作製には一般的なコンピテントセル作製方法をそのまま流用することは可能でしょうか？例えばバイオ実験イラストレイテッド�Aの83ページ〜（コンピテント細胞作製）やキットではZYMO RESEARCH社のZ-Competent E. coli Transformation Kitなどを使って作製できるのでしょうか？ 皆様、アドバイスをお願いいたします。

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