全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

レンチウイルスベクター 削除/引用 No.1680-11 - 2010/05/12 (水) 05:45:16 - はまじ ちょっと遅すぎる気がしますが、少しでも参考になれば幸いです。 私はU937内の遺伝子をノックダウンしたことがあります。その際に使用したのはshRNA発現レンチウイルスベクターです。GFP発現レンチウイルスベクターを用いて効率も確認しておりますが、ほぼ100％の細胞がGFPを発現していました（FACSにて確認）。目的の遺伝子のノックダウン効率も非常によいです。 実際にはSigmaAldrichのMission shRNAのシステムを使用しております。 http://www.sigmaaldrich.com/life-science/your-favorite-gene-search.html 調べたい遺伝子に対するshRNAをコードしたプラスミドを購入してご自身でレンチウイルスベクターを作ることも出来ますし（多少のバックグラウンドの知識が必要かもしれません）、既に調整済みのshRNA Lentiviral Transduction Particleを購入することも出来ます（割高ですが）。 私は行っておりませんが、必要ならば薬剤によるセレクションでステーブルノッウダウン細胞を得ることも出来るはずです。

(無題) 削除/引用 No.1680-10 - 2010/04/02 (金) 16:38:26 - ぱぱにころう 浮遊系細胞のtransfectionにはNucleofectorがお薦め。 ただ、siRNAの量やエレポ時のプログラムを調整する必要がある。 あとコストパフォーマンスもよろしくない。 それでもNucleofectorがいいのは、通常のエレポでも入りにくい細胞でも核膜内までsiRNAやplasmidを放り込んでくれる（あくまで比較的）。Lipofectamineでは細胞膜表面にベタベタとくっつくところまではいいがその後の取り込みが上手くいかない。。。 Nucleofectorは特性上、siRNA導入はもちろん、stable cellの作成にも効果が高い（あくまで比較的）。 と、amaxa（今はLONZAか）のまわし者のようないいようだが、実際に白血病やリンパ腫細胞株で効果は良かった。てか、これ以外では正直結果を出すのに時間がかかり過ぎるし、十分なデータが得られない。 しかし研究資金があるうちは良いが、無いときに導入試薬だけで一回2-3千円はかなりきついので、Lipofectamineで出来るならそれに越したことはない。 まぁ経験上、データ取りにいざ扱う時に限ってLipofectamineでは入らない細胞だったりすることが多いが。。。 そんな時は諦めて通常エレポに切り替えて条件検討からコツコツやるしかない。。。

(無題) 削除/引用 No.1680-9 - 2010/01/25 (月) 15:08:09 - ごんべい うーん。 リポフェクションではやはり苦しいでしょうかね。 >経験では、導入効率は30％程度だったと思います。ちょっと高いのが難点ですが。。。 30%だとsiRNAの効果を観るのも難しそうですね。

(無題) 削除/引用 No.1680-8 - 2010/01/24 (日) 22:23:40 - すぶりをするそぶり 均一なトランスフェクションになるようにプロトコール修正するなら、 ＞2.そのチューブに、浮遊細胞の懸濁液を入れる。 ＞3.軽く遠心して、細胞をペレットにする。（複合体と細胞の接触機会をつくってやる） 遠心を行わず、2.で加える細胞の密度を出来る限り濃く （30min〜１h程度の培養で細胞が死なない程度) してやれば、目的にはかなうかな。 複合体も、全部がプラスチック壁に吸着するわけではないので 遠心は必須条件にはならないと思う。 実証してない思いつきですがね。

(無題) 削除/引用 No.1680-7 - 2010/01/23 (土) 18:17:23 - 他人のそら言 細胞と複合体を混ぜ合わせてから細胞がつぶれない程度に弱く遠心すれば、言うほど不均一にならないような気がしますが。。。 それはさておき、 過去にK562にsiRNAを導入したことはありますが、そのときは不活化センダイウイルスによるトランスフェクションを行いました。 ttp://www.iskweb.co.jp/hvj-e/default.htm 経験では、導入効率は30％程度だったと思います。ちょっと高いのが難点ですが。。。 (ちなみに、企業のまわしものではありません)

(無題) 削除/引用 No.1680-6 - 2010/01/22 (金) 19:05:48 - すぶりをするそぶり おっしゃるとおりで、細胞全体に均一にトランスフェクションはできないと思います。

(無題) 削除/引用 No.1680-5 - 2010/01/22 (金) 18:54:17 - ごんべい >自分で実験する機会があれば 1.遠心ができるチューブ内でsiRNAとRNAiMAXを混ぜて複合体形成。 2.そのチューブに、浮遊細胞の懸濁液を入れる。 3.軽く遠心して、細胞をペレットにする。（複合体と細胞の接触機会をつくってやる） 4.そのまま30分ほどincubate 5.細胞を懸濁しなおして、培養容器に移して培養再開。 せっかくのお説にいちゃもんを付けるようで申し訳ないのですが、この場合細胞ペレットの上部表面の細胞しか複合体と接触する機会が得られないような気がしてしまいますが、考え方が間違っていますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1680-4 - 2010/01/22 (金) 17:04:35 - すぶりをするそぶり 浮遊細胞でのsiRNAトランスフェクション、興味はあるのですが 実際に実験したことが無いので、レスをつけるのは控えてました。 接着細胞でのRNAiMAXの使用経験からの推測ですが siRNA/RNAiMAX複合体は、沈殿しプラスチック壁に吸着する性質を持つようです。 接着細胞の培養系で、Invitrogen推奨のReverseTransfectionを行なうのでしたら この性質をポジティブに利用して、複合体と細胞の接触効率を増やすこともできますが、 浮遊細胞の培養系に加えたとしたら、siRNA/RNAiMAX複合体は 培養容器の底に沈んで、細胞と接触する機会が乏しいのではないかと。 Invitrogenのサイトでも、浮遊細胞でのRNAiMAXの使用例はとりあげていません。 http://www.invitrogen.jp/rnai/cationiclipids.shtml#ref23 （Oligofectamine か DIMRIE-C が、浮遊細胞での使用について記述あり） 接着細胞に対して有効なRNAiMAXも、浮遊細胞には不向き？ 自分で実験する機会があれば 1.遠心ができるチューブ内でsiRNAとRNAiMAXを混ぜて複合体形成。 2.そのチューブに、浮遊細胞の懸濁液を入れる。 3.軽く遠心して、細胞をペレットにする。（複合体と細胞の接触機会をつくってやる） 4.そのまま30分ほどincubate 5.細胞を懸濁しなおして、培養容器に移して培養再開。 みたいなプロトコールを試すところですが…まあ、お聞き流し下さい。

(無題) 削除/引用 No.1680-3 - 2010/01/22 (金) 14:28:55 - ごんべい さっぱりレスがつかなかったので諦めていましたが、ご報告ありがとうございます。 大変参考になりました。これから調べてみようと思います。 特殊な装置が必要となると今すぐにでも始めるというわけにはいかないところが難点ですね。

(無題) 削除/引用 No.1680-2 - 2010/01/22 (金) 10:26:41 - 超初心者 私も普段浮遊細胞を実験対象としており、いずれsiRNA実験も必要だろうと思っておりましたので、このトピに注目してました。で、最近いよいよsiRNAの検討を始めることになり、導入方法として選択したのはLONZAのNucleofectorでの導入です。この機器の詳細は他を参照いただきたいのですが、siRNAのノックダウンはreal time PCR、western blottingともに確認できました。ただ、細胞株によっては、市販のGFPベクターとGFPに対するsiRNAのコトランスフェクションでノックダウンが確認できるにもかかわらず、目的遺伝子のsiRNAではまったく効果がない、という現象があり、理由がわかりません。（同じsiRNAで、他の細胞株ではきちんとノックダウンが確認できる）まだいろいろと検討の余地がありそうですが、とりあえず浮遊細胞を対象としたときの導入方法としてNucleofectorは使えそう、という点を報告します。

浮遊細胞にsiRNAトランスフェクション 削除/引用 No.1680-1 - 2009/12/04 (金) 12:23:43 - ごんべい これまでほとんど浮遊細胞は暑かったことはなかったのですが、最近U937細胞等浮遊細胞にsiRNAをトランスフェクションする必要が出てきました。今のところ（他の細胞では有効なsiRNAでさえ）全く効果が得られていません。使った試薬は他の細胞ではかなり良い成績が得られているInvitrogen社のLipofectamine RNAiMAXです。 浮遊細胞にトランスフェクションするのは難しいと聞いていましたが、siRNAはまだ入る方だと聞いています。 現在、U937細胞等にsiRNAのトランスフェクションを動かしていらっしゃる方がいらしたら、現時点で一番良いと思われる試薬などを教えて頂けませんでしょうか？

全11件 ( 1 〜 11 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---