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訂正 削除/引用 No.168-8 - 2009/03/15 (日) 15:16:00 - 32 N末端⇒5'末端 ですね。

(無題) 削除/引用 No.168-7 - 2009/03/15 (日) 15:14:41 - 32 SMARTの5'Rを以前やっていましたが、一度のPCRではN末端まで取れず、5'R⇒SEQ確認、新たに確認した配列中でGSP設計⇒5'R⇒SEQ確認と繰り返してやっと解析できたものがあります。RNAの構造で逆転写の際に伸長されづらい、あるいはPCRでの増幅の際にもその構造が問題となっているのかはわかりませんが。 あと、kitのUPMのアニーリング温度が高いせいなのか、templateの構造の問題かはわかりませんが、GSPを何パターンも試すということが必要なこともありました。 PCR条件をタッチダウンで行うなども工夫もしました。 あと、5'RのPCRの酵素をKOD-FXやCGリッチに強いものに変えるなども効果がありました。

(無題) 削除/引用 No.168-6 - 2009/03/11 (水) 18:11:10 - Pumpkin つまり、全体のmRNAをsscDNAに逆転写せずにターゲットの遺伝子断片をプライマーとして、ターゲット遺伝子の上流だけ逆転写しようということですね。そうすれば基本的に逆転写されたものはターゲット遺伝子のsscDNAである確率が高くなるから、SMART2オリゴとこの特異的プライマーとでPCRがかかりやすいだろうということですね。 できるかと言われれば、olig dTプライマーと特異的プライマーの違いしかありませんから逆転写は問題なくできると思います。 ただし、コントロールは働き、3'RACEも働いたのに、5'RACEが働かないということから、例えばRNAへの高次構造やRNA調製の不具合で切れていたりともともと5'領域が伸びない原因があるかもしれません。そのあたりのこともあるので一概に打開策になるかというとそうでもないかもしれませんし、うまくいくかもしれません。 あと、この手のキットは価格が高いですから、最初のcDNA合成は網羅的にやっておいて、ここの目的遺伝子に対して使っていきたいという思惑もありますよね。もちろん標的遺伝子を取るために多少の金額は問題ないというのであれば、やってみるのも良いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.168-5 - 2009/03/11 (水) 16:14:43 - 山ちゃん >Pumpkinさま 説明が拙く申し訳ありません。 5'RACE(SMART法)は、 mRNA（total RNA） ↓ oligo dTプライマを用いて逆転転写によりcDNA合成 (同時に、cDNAの5'末端にSMARTIIオリゴ付加-※1 ↓ 合成したcDNAをテンプレートにして、 degenerated PCRの結果から確認した 内部の塩基配列をreverseプライマに、 SMARTIIオリゴの既知配列をforwardプライマに してPCRにより、5'末端を増幅すると思います。 この時、「※1」のoligo dTプライマを、 degenerated PCRの結果から確認した内部の塩基配列をreverseプライマに置き換えられるかどうか？という質問です。

(無題) 削除/引用 No.168-4 - 2009/03/11 (水) 12:00:33 - Pumpkin >【内部配列領域（一部）の増幅�C】で得られた、配列をプライマにしてcDNAは合成できるか degenerated primer同士で増幅された産物をクローニングして塩基配列決定。その塩基配列をもとに作製したfoward primerとoligo dT primerでmRNAから逆転写できるのか、ということですよね。問題ありません。逆転写はsscDNAしかできませんから、PCR的に特異的dscDNAを得るということですよね。 ただ、5'RACEはその内部配列から5'上流を得ようとしているわけですよね。得られた断片からpolyAまでは得られても、上流はやはり得られないということになるかと思いますが。 あと、ウラシルについての解釈が良く分からないのですが、ともかく得られた配列からPCRはかかりますよ。もちろんdegenerateしたプライマー配列は用いないで、プライマーに挟まれた増幅領域を使うべきですが。

(無題) 削除/引用 No.168-3 - 2009/03/11 (水) 11:40:44 - 山ちゃん >Pumpkinさま お世話になります。 PCRの原理とRACEの原理は、大丈夫だと思います。 新規なタンパク質をクローニングする場合、一つには タンパク質精製�@ ↓ ペプチドシークエンスによる内部配列の確認�A ↓ degenerated primerの合成�B ↓ 内部配列領域（一部）の増幅�C ↓ RACEによる5'と3'末端の遺伝子配列の取得�D かと思います。 そのなかで、RACEを行う際にはcDNAの合成が必要です。 cDNA合成は、oligo dT プライマを使用しますが、 その代わりに、【内部配列領域（一部）の増幅�C】 で得られた、配列をプライマにしてcDNAは合成できるかな？ と思ったわけです。 ただRNAは、ウラシルを使用しているので、そこを除いた 領域でないと難しいのかのか、、と 思っております。

(無題) 削除/引用 No.168-2 - 2009/03/11 (水) 11:02:43 - Pumpkin まず、oligo dT プライマーはDNAオリゴです。 次に、クローニングしたい遺伝子の配列が分かっているのであれば、PCRの原理からいって目的cDNA合成の特異的な増幅が可能です。この質問からはPCRの原理について理解しているか不安ですが、そこは問題ないですか？ 次に、5'RACEないし3'RACEというか、RACE法の原理をご存じですか？RACE法は既知cDNA配列を使って、そのcDNAの未知配列部分を決める方法です。よって、断片としてしかcDNA情報が手元になくとも、全長cDNA配列を決めるのに有効な手段なわけです。もともと全長の配列が分かっているのであれば、特異的なプライマーを用いて一気にPCRで単離するのが普通かと思います。

cDNA合成時のプライマーについて 削除/引用 No.168-1 - 2009/03/11 (水) 09:06:01 - 山ちゃん 基本的な事かも知れませんが、よろしくお願いします。 cDNA合成を行う際は、polyAテールにアニールするoligo dTプライマを 使用しますが、このoligo dTプライマはDNAなのでしょうか？ ならば、クローニングしたい目的遺伝子の内部配列が解明されていれば その内部配列をmRNAの相補プライマとして、 目的遺伝子特異的なcDNA合成を行うこと可能なのでしょうか？ と、いいますのは、SMART法で5'RACEを行っていますが、増幅が見られず 条件検討を色々と行っています。 ※kit付属のポジコンでは、5'RACEは問題なく行えています。 ※3'RACEは、うまくできました。 5'RACEがうまくいかない原因は、目的mRNAの量の問題とテンプレート転移反応の問題であると考えております。 ですので、目的遺伝子特異的なcDNA合成が可能であれば、上記の問題も 改善できるのでは、、、と考えております。 よろしくご教示ください。

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