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皆様ありがとうございます。 削除/引用 No.1678-19 - 2009/12/06 (日) 12:42:27 - かよこ ＞コラーゲンコートは必須のような気がします。 わかりました。 ＞精製時に失活するトラブルについてもアドバイスできるといいのですが 今回使用されているキットを使ったことが無いのと、 アデノウイルスの精製時の失活は、研究室全体で１０回精製して１回失活する程度のアクシデントで Buffer類を全て作り直し、細心の注意を払ってもう一回精製すれば 連続で失敗するということもなかったので、失活の原因はわからずじまいです。 わかりました。取りあえず、精製前のウイルス液での発現が確認できた後、再度増幅、精製しなおしてみたいと思います。前回は初めての精製だったので、多少手際が悪かった気もしますし。 ＞もし精製は全くいらないとお考えの方がいれば、ぜひともコツやプロトコールを教えていただきたいですね。 私からも同様に、その様な方にご意見を伺えたらと思います。

(無題) 削除/引用 No.1678-18 - 2009/12/05 (土) 15:04:08 - heimlich 現在、Clontech社のアデノウィルスを作成して、実験しているものです。 未精製のGFP-Adenovirusを標的細胞に感染させて、ほぼ100%の効率を得たことがあります。プロトコールとしては、一般のものと変わらないと思います。ただ、同様に他の遺伝子を入れたアデノウィルスは、発現蛋白量が極めて低く、これから大量調整したのち濃縮予定です。かなり、目的遺伝子によって違う印象を受けます。 ちなみに、Adeno-X Rapid Titer Kitに関して、あれはタイターが結構高くないと見えないですよね？GFPがほぼ100%のタイターでも、ほとんど見えなかったのですが、他の方の感想はいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1678-17 - 2009/12/05 (土) 03:15:00 - Kazu コラーゲンコートは必須のような気がします。 私も塩化セシウムを用いて精製していましたが、他のラボでは培養上清をそのまま感染実験に用いているところもありました（プロトコールは不詳）。この場合、発現を確認するとき、未精製のため目的たんぱくの持ち込みで偽陽性にでることもあるので気をつけないといけないという話を聞いたことがあります。 そぶりさんの話では上清を感染実験に使うのは難しいとのこと。 もし精製は全くいらないとお考えの方がいれば、ぜひともコツやプロトコールを教えていただきたいですね。

(無題) 削除/引用 No.1678-16 - 2009/12/04 (金) 21:14:05 - すぶりをするそぶり >私はウイルスの増幅後の精製は、必要なものだと理解していましたが、 >培養細胞に対しての感染では未精製のもの（遠心で細胞を除いた上澄み）を >用いることも可能なそうですね。 これは私も挑戦してみたのですが、ダメでした。 LacZ組み込みアデノウイルスを未精製（培養上清）とCsCL精製後で、 同じMOIで培養細胞に感染させて、β-Gal染色で感染効率を検討すると 精製後のアデノウイルスを使用すると、ほぼ100%の細胞が染まるMOIで 未精製のアデノウイルスでは1~5%程度しか染まりませんでした。 なぜここまで差がでるのか？検討してみたかったのですが、 それに使える時間が無かったので、あきらめて精製してから実験しました。 細胞の種類や、実験系によっては使えるのかも? 私としては、タイター測定で何かトラブルがあったときに ポジコンとして使用することぐらいしか考え付きません。 精製時に失活するトラブルについてもアドバイスできるといいのですが 今回使用されているキットを使ったことが無いのと、 アデノウイルスの精製時の失活は、研究室全体で１０回精製して１回失活する程度のアクシデントで Buffer類を全て作り直し、細心の注意を払ってもう一回精製すれば 連続で失敗するということもなかったので、失活の原因はわからずじまいです。

再度ありがとうございます。 削除/引用 No.1678-15 - 2009/12/04 (金) 19:39:53 - かよこ ＞パッケージ細胞として何を使用すればいいのかは、重要な基礎知識なので 御自身で確認下さい。 わかりました。 ＞長期培養でも細胞がはがれにくいプレートの選定は検討ずみでしょうか？ コラーゲンコートの方がいいことは知っていたのですが、実際にはコートなしのもので行っていました。それが主な原因かもしれません。 タイター測定用キットのご推奨、ありがとうございます。 検討させて頂きます。 申し訳ありませんが、もう一度、質問させていただきます。 私はウイルスの増幅後の精製は、必要なものだと理解していましたが、培養細胞に対しての感染では未精製のもの（遠心で細胞を除いた上澄み）を用いることも可能なそうですね。 その場合の遠心速度等のプロトコルや、情報のあるサイトなどお教えいただきたいです。 今一度、宜しくお願い申し上げます。

再度ありがとうございます。 削除/引用 No.1678-14 - 2009/12/04 (金) 19:32:08 - かよこ

(無題) 削除/引用 No.1678-13 - 2009/12/04 (金) 16:00:00 - すぶりをするそぶり アデノウイルスベクターも改良が進んでいるようで、 かよこさんが使っているアデノウイルスが改良第何世代のベクターに相当するのかは知りませんが 私は、「遺伝子欠損により専用のパッケージ細胞でないと増殖できないアデノウイルス」 と「専用のパッケージ細胞を使用してのTCID50法」を想定して返答してます。 パッケージ細胞として何を使用すればいいのかは、重要な基礎知識なので 御自身で確認下さい。 >ウイルスが失活しているならば、高濃度で与えた場合に発現してほしいわけですが、 私の経験では、精製後に高いPFU値がでなかったアデノウイルス精製液では 目的遺伝子発現より先に細胞への毒性の方が強く出るので、使い物にならなかったです。 失活したアデノウイルスも同様です。 （失活しても毒性だけは残ります。） ですので、今回の話も単にウイルスが失活しただけなのではないかと思いました。 >すると、TCID50法で見られる細胞の様子ですが、接着が弱いHEK293Tがウイルス希釈に関係なく、 >剥離してきているのかも知れません。 話を聞いて思い出したのですが、TCID50法に関しては コラーゲンでプレコートされた96well plateを この実験の為だけに買っていました。 （コストはかかるのですが、師匠にそう教わったので特に疑問も無く） 長期培養でも細胞がはがれにくいプレートの選定は検討ずみでしょうか？ 今までの書き込みを見て、atsさん推薦のAdeno-X™ Rapid Titer Kit　は 時間短縮できる点が大変魅力的に思えました。 http://catalog.takara-bio.co.jp/clontech/product/basic_info.asp?unitid=U100006188 私は実際に使ったことが無いのですが、使用検討をおすすめしたいところです。

さらに、追加です。 削除/引用 No.1678-12 - 2009/12/04 (金) 14:17:00 - かよこ ウイルスが失活しているならば、高濃度で与えた場合に発現してほしいわけですが、前にも書きました通り細胞が変性してしまいます。元気そうなうちにサンプリング（感染後24時間くらい）したものでも、発現の増加は見られませんでした。 変性というのはいわゆる、細胞が粒状になり死に始めます。これはウイルス液の濃度に依存した程度で見られる現象です。明らかに同時期に撒いた非感染の細胞とは異なります。 ということは、失活したウイルスが多く含まれている上に、微量のウイルスが自己増殖可能となってしまったということなのでしょうか。でも自己増力可能なものが含まれるにしては、細胞が死に始めるのが遅いようにも思います（1/1000希釈では、3日後までほぼ正常です）。 そのあたりが、不思議です。

またまた申し訳ありません。 削除/引用 No.1678-11 - 2009/12/04 (金) 13:58:02 - かよこ 先程の書きこみに誤りがあったので訂正させてください。 「失活したウイルスによる溶解」と書いてしまいましたが、すみません、早とちりでした。すぶりをするそぶり様のお話を読み間違えてしまいました。 すると、TCID50法で見られる細胞の様子ですが、接着が弱いHEK293Tがウイルス希釈に関係なく、剥離してきているのかも知れません。 取り急ぎ、訂正です。

書き忘れました。 削除/引用 No.1678-10 - 2009/12/04 (金) 13:40:23 - かよこ CaP様、ご指摘どうもありがとうございます。 大学への申請の下、P2レベルの実験室、安全キャビネット内で扱っております。

ありがとうございます。 削除/引用 No.1678-9 - 2009/12/04 (金) 13:37:50 - かよこ 皆様、大変丁寧なご回答、どうもありがとうございます。 皆様のご指摘によれば、HEK293T細胞を用いている点、ウイルスの失活が問題ではないかとのこと、自分では全く思い至りませんでした。 まずTCID50法に関してですが、すぶりをするそぶり様のご指摘の「失活したウイルスによる溶解」である気がしてきました。最も高濃度にウイルス液を加えたものでは、細胞がみな剥離しているように見えますが、多くの希釈段階ではほぼ差がなく変性（一部は剥離しているようで、一部はまだ接着できていそうな様子）しています。 精製の段階で、HEK293T細胞に感染させ、増幅、精製（abm社のAdd-N-Pure viral purification kit）を行いました。5.5×10^12 particle titer/mlとは、精製後のウイルス液を測りました。 TCID50法でHEK293T細胞があまり適さないかもとのことですが、増幅させるのにも、HEK293T細胞は適していないということでしょうか？それとも、増幅は可能だけれど失活したものが含まれる可能性がある、ということでしょうか？HEK293T細胞を用いて増幅、精製するときに具体的な注意点等ございますか？ そもそも（Tでない）HEK293細胞を用いることがやはり必要なのでしょうか？ 再度、質問してしまい申し訳ありません。宜しくお願いします。 取りあえずまずは、自分が精製する前のウイルスを試して見ようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1678-8 - 2009/12/04 (金) 11:07:30 - ats titer測定はTCID50法より、クロンテック社のAAdeno-X Rapid Titer Kit が簡便・早くて（3日）おすすめです。頻繁に行うのであればprotocolをDLして、一次抗体等を別途購入した方がかなり安上がりです。 他の方も指摘していますが、293Tをアデノウィルスの増殖に使うのはお奨めできません。 dish接着性が293より弱く、TCID50法の判定も難しいのではないでしょうか。 heimlichさんのご指摘にもありますが、b-Galを発現するコントロールウィルスで、目的細胞への感染性を比較した方が良いです。細胞によっては、293細胞の500倍以上のウィルスが必要な細胞もあります。この場合は、精製virusとPEIを併用すると、virus必要量を減らすことができます（ダメな場合もあり）。

293Tですか？ 削除/引用 No.1678-7 - 2009/12/04 (金) 04:11:26 - CaP 大変そうですね。タイターが不明なままの実験は不安でしょう。できれば避けたいモノです。 読んでみて最初に気になったのは293Tを使われている点です。レトロやレンチではトランスフェクションによってウイルスを作成するためT抗原でトランスフォームした293Tが必要ですが、アデノウイルスは感染を繰り返して増やすためTなしの（HEK）293で十分です。これは推測ですが、293Tの方がウイルス感染に対する感受性が高く、そのせいで「変性」しているように見えるのかもしれません。状態の良い（これも難しいところなのですが）293細胞ならば、MOI（ウイルス対感染細胞比）が低い場合はほとんど変化が無く、ウイルスなしのコントロールと変わらないはずです。低い、というのはおおざっぱには1以下、といったところでしょうか。1を超えると1〜2日で細胞がディッシュから浮くといった変化が出てくるはずです。 ODのタイターが正しいのであれば、対象細胞数にも寄りますが1/10とか1/100といった希釈率ではかなりな量のウイルスになりかねません（なのでその状態で発現が見られない、というのが不思議なのですが）。濃い希釈率で「変性したように」なっているのはイコール発現している、ということなのでしょうか？よほど特殊なモノでない限り、（発現を見るのに）最適な希釈範囲が狭い、ということはないと思います。ちなみにODのタイターを測定したのはCsClなどで精製したウイルスでしょうか？それとも培養上清？5.5×10^12 particle titer/mlだと精製後だと思われますが、とりあえずこのODタイターを信じるとして、感染有効タイター（通常はウイルスとして存在していても感染できないものが多数含まれます）がおよそ1/100ですから、それを基準にMOI=5〜10で感染実験をしてみるのも手かもしれません。どのようなタンパク質をどうやって検出しているのかわかりませんが、そのMOIで発現が観測できないとなれば何かが根本的に間違っている可能性があります（ちなみにPCRで検出されたからといって発現するとは限りません）。対象細胞も人間ならばほとんどの場合で感染が得られますが、齧歯類の細胞株だと感染率が低い場合があります。 あと、かよこさんがどこにおられるのか分かりませんが、少なくとも米国ではウイルスを扱うためには様々な手続きが必要です。例え危険性の低いアデノウイルスでさえそうです。全く初めて扱っておられるようですが、老婆心ながらそちらの方は大丈夫ですか？

293T 削除/引用 No.1678-6 - 2009/12/04 (金) 04:06:18 - CaP

(無題) 削除/引用 No.1678-5 - 2009/12/03 (木) 22:58:34 - heimlich 使用されている哺乳類細胞は、adenovirusの感染レセプターは持っていますか？

(無題) 削除/引用 No.1678-4 - 2009/12/03 (木) 22:00:04 - Adeno 増幅するときに使用したHEKに問題はないですか？ 使用するHEKによって、アデノウィルスのタイターが大きく変化します。

(無題) 削除/引用 No.1678-3 - 2009/12/03 (木) 19:49:18 - すぶりをするそぶり タイター測定ですが、50%変性点以前に 最も高濃度にウイルスを加えた実験区で、 ほとんどの細胞が剥離/溶解する現象は確認できていますでしょうか？ プロトコールでは、50%以上細胞が変性しているかどうかを判別していくことになっていますが、 私が行なっていたTCID50法では、実際は失活していないアデノウイルスが１つでも入っているウェルは ほぼ全てのHEK293T細胞が溶解していたと記憶しています。 長期培養後に生き残った細胞はかなり無残な形態をとりますが、 失活していないアデノウイルスがウェルに入ったかどうかは 細胞の形態変化どころではないので、はっきりと見分けがつきました。 ですのでお話を伺った第一印象は、タイターが高すぎるの真逆で 「精製に失敗してアデノウイルスが失活してしまい、測定範囲外の低タイターになっている」 です。 アデノウイルスは精製する段階で失活することがあります。 私自身も経験がありますし、同僚が同じ目にあったのも見たことがあります。 ・高濃度でタイター測定をしてみる。 ・精製前のアデノウイルス含有液でTCID50法を行う。 などで、まずはTCID50法に慣れることをお勧めします。

補足 削除/引用 No.1678-2 - 2009/12/03 (木) 18:43:51 - かよこ 補足です。 ウイルス自体は、他のラボから頂いたもので、自分でキットを用いて増幅、精製しました。 ウイルスはvivoでの実験で、既に目的遺伝子の強制発現に成功しているものです。

アデノウイルスによる強制発現 削除/引用 No.1678-1 - 2009/12/03 (木) 18:32:47 - かよこ 細胞実験初心者です。 アデノウイルスを用いて哺乳類細胞にある遺伝子を強制発現させようとしています。 しかしながら、恐らく感染させるウイルス濃度が最適でないのか、ウエスタンをしてもタンパク質の増加は見られません。 まず一つの問題としてタイターが現時点で測れていません。TCID50法により、HEK２９３T細胞での50％終末点を計測しようと試みておりますが、播種後数日で非感染細胞を含む細胞が変性（？）したような状態になり、どの希釈のwellの細胞も同じような変性状態を示します。 播種時点での細胞密度が高すぎる為に、環境収容力を超えてしまうことによる影響だと思い、比較的低密度でも試みましたが同様の状態になりました。 なので、一つにはタイターが高すぎる可能性も考えています。 タイターが測れていないのですが、時間的制約があるために段階希釈したウイルス液を用いて実際に感染させて、強制発現を試みています。 濃い希釈液（1/10）では、細胞は感染後24時間を過ぎたあたりから変性したようになり、薄い希釈液（1/1000）では、73時間後までのタンパク質サンプルを回収しても、非感染に比べて目的のタンパク質が増加している傾向はありません。 変性に関しては、自己増殖能の可能性も疑ってはおりますが、PCR実験、HeLaを用いた実験においても、自己増殖能を獲得している裏付けはとれていません。 1/100希釈においても、48時間以降くらいには変性が顕著になります。 ウイルスを用いた感染は、初めてなので全く感覚がつかめておりません。 感染における最適なウイルス液の希釈というのは、ごく狭い範囲なのでしょうか？ ちなみに、ウイルス液のOD260を測ったところ、5.5×10^12 particle titer/mlでした（なので1/100希釈くらいでいけると思っていたのですが…）。 さらには、ウイルスが目的遺伝子のコンストラクトをもっていないことまで疑ってPCRしてみましたが、ちゃんと遺伝子は持っていました。 大変困っております。 アデノウイルスを用いての強制発現にお詳しい方のご教授を承りたいです。 どうかよろしくお願いします。

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