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参考になるかどうかわかりませんが 削除/引用 No.1676-9 - 2009/12/05 (土) 10:29:06 - かわさき 私の経験ではウサギIgGはケラチン５とFCを介して結合し、上皮だけが非特異的に染色されます。ただしマウス抗体とヒト組織の組み合わせではこのような現象は経験したことはありません。 お話では組織全体が一様に染まるとの事。一番考えやすいのは皆さんがおっしゃっているように、抗体の力価が低いため、DAB反応時間を延ばしてしまい、結果として”ベタ染まり”になっているのではないかということです。まずはその抗体が染色できる実績のある抗体かどうかということを確認すべきでしょうね。 また目的の組織で間違いなくそのタンパクが発現しているということ、組織の質は大丈夫かということ。固定は問題ないか、などについても再度検討されたらいかがでしょうか？ たとえば凍結組織などで切り置きする人がいますが、切ってしまうと抗原性の持ちは相当に悪くなります。またたまーにタンパクによっては固定でだめになることがありますね。あとは界面活性剤でむしろ染色しなくなるタンパクとか、細胞質タンパクならアルデヒド系の架橋系の固定でないと染色中に流れ去ってしまうことも多いです。

(無題) 削除/引用 No.1676-8 - 2009/12/05 (土) 02:48:38 - Boston >[Re:7] うさんは書きました : > まず、組織は何でもいいので必ずシグナルがでるはずのサンプルを用意して > 質問者様がちゃんとした手技をもっているのか？ > 使っているキットがうまくワークするのか？ 全く同感です。１次抗体の質が悪いと、発色の時間を延ばしがちですー当然バックが高くなります。DAB 染色で１０分でシグナルが出ないようであれば、バックがあがらないように工夫するより、１次抗体を如何に抗原に認識させるかに集中したほうが良いかと思います。 他のトピでコメントを書きましたが、表面抗原を認識する抗体は立体構造が重要なので、抗原性がなるべく保持されやすい凍結切片を試されるのも手かと思います。

(無題) 削除/引用 No.1676-7 - 2009/12/04 (金) 13:50:38 - う まず、組織は何でもいいので必ずシグナルがでるはずのサンプルを用意して 質問者様がちゃんとした手技をもっているのか？ 使っているキットがうまくワークするのか？ などなど、もろもろのことをチェックするために ポジコンをおきましょう。 そして、そのポジコンでシグナルが出るのであれば、 それと全く同じ条件で目的組織の実験を行いましょう。 もしくは、絶対に出るという組織を目的組織と同じ条件で用意して シグナルが出るのかを確認するのもいいでしょう。 まずは、基本からじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1676-6 - 2009/12/04 (金) 13:44:46 - AP 一次抗体なしのネガティブコントロールはどうなるでしょう。一次抗体の希釈をあげても結果が変わらないということから、二次抗体の非特異的吸着の可能性もあると思われますが。 >バックの色が抑えられるくらいまで抗体の濃度を下げたとすると、陽性細胞も薄くなると考えられますし、、、 一般論ですが、特異的な抗原抗体反応の解離係数は、非特異的な結合よりはるかに小さいので、十分に希釈することによって、特異的結合を残して非特異的結合を抑えることができます。 しかし、いくらモノクロのように特異性の高い抗体であろうとも、抗原抗体反応に拠らない強いアフィニティー、たとえばFc領域の親和性（Fcレセプターなどによる）で非特異的染色が起こる例が少なからず知られています（Fc nonspecific stainingなどのキーワードでググって見てください）。それに照準をあわせたブロッキングをおこなうとか、抗体をF(ab')2断片にするとかの対処が考えられます（そういう問題については実経験に乏しいので、詳しい人に任せます）。

(無題) 削除/引用 No.1676-5 - 2009/12/04 (金) 13:14:25 - CJ ＤＡＢ染色時のbackgroundのことですね。また、シグナルはでているようですね。 ＤＡＢ反応はどれくらい行っていますか？反応停止はどのような基準で行っていますか？反応は温度に敏感ですので、実際に反応を見ながら停止するのが良いでしょう。私の場合、顕微鏡でシグナルとバックグランドの両方をチェックしながら、バックグラウンドが上がる前に反応を停止しています。

(無題) 削除/引用 No.1676-4 - 2009/12/04 (金) 11:39:04 - ruu SY、CJさん 組織はヒトの膝滑膜組織です。 目的とする抗原部位以外のところ、組織全体バックグラウンドに薄く色がつき特異性がみられない状態になってしまいます。 抗体はマウスIgG1なので、非特異的になるとは思えません。 ちなみに、２次抗体はニチレイのヒストファインを使用しており、ビオチンの影響を受けないそうです。 バックの色が抑えられるくらいまで抗体の濃度を下げたとすると、陽性細胞も薄くなると考えられますし、、、 やはり、組織自体の問題と考えた方がよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1676-3 - 2009/12/03 (木) 17:21:36 - CJ 共染とは何のことですか？ 蛍光多重染色しているときに２つの２次抗体が同じものを染める現象でしょうか？ でしたら、それはcross reactionですから、２次抗体がお互いに反応しないようにhighly absorbedのものを使用する必要があります。 なお、もしこれが蛍光染色なのだとしたら、内因性ペロキシデースのブロックは必要ないです。

(無題) 削除/引用 No.1676-2 - 2009/12/03 (木) 17:17:21 - SY ヒトの何の組織かにもよりますが、２次抗体の抗原認識部位の影響は調べましたでしょうか？ 組織によってはwhole IgGを使用すると非特異的な染色が出ることがあるかと思います。

免染の共染対策 削除/引用 No.1676-1 - 2009/12/03 (木) 16:28:57 - ruu いつも拝見しています。 今回、免染に関してのご相談です。 現在、ヒト組織をCD4で染めているのですが、どうしても共染してしまうのです。考えられる対策として、 �@内因性ペルオキシダーゼ除去：３％H2O2メタノールによるブロッキング �A賦活化処理：酵素処理だと反応が弱いので、pH9のBufferによるMW処理（AC処理だと強すぎると思われたので） �B一次抗体の濃度：調整済みの抗体なので説明書どおり（室温、1Hr)に使用していましたが共染が見られるので10倍、50倍、100倍と濃度を分けました �C各種反応間の洗浄を5min×3 など、行ったのですがあまり違いが見られません。 組織のホルマリン固定の時間が長すぎる（おそらく2〜3週間は漬けっぱなし）からでは、、、という意見もありました。 何かアドバイスがありましたら、よろしくお願いします。

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