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神経細胞の蛍光抗体方法 トピック削除
No.1670-TOPIC - 2009/12/02 (水) 20:07:17 - パグ
はじめまして。現在誘導神経細胞の蛍光抗体反応をしているのですがあまり上手く検出されません。もし詳しいプロトコールをお知りの方がいたら教えてもらえないでしょうか。

手順としては

PBS(−)で洗浄(5min×3)

4℃の2%パラホルムアルデヒドでインキュベート(30min)

PBS(−)で洗浄(5min×3)

ドライヤー(冷風)で完全に風乾

PBS(−)で洗浄(5min×1)

3%TritonX-100 in PBS(−)でインキュベート(5min)

3%goat serum in PBS(−)でブロッキング(60min)

一次抗体反応(4℃, O/N)
   0.05%Tween20 in PBS(−)
   3%goat serum
neurofilament68(総量の1/800)

0.05%Tween20 in PBS(−)で洗浄(10min×3)

二次抗体反応(室温,3h)
   PBS(−)
   BSA(1mg/ml) 総量の1/1000
   3%goat serum
5%Tween20 in PBS(−)
   Alexa488

0.05%Tween20 in PBS(−)で洗浄(10min×3)

以降はDAPI染色をしてカバーガラスへ封入しています。蛍光観察の際は核染色はされていることから実験手法がおかしいのかただ神経への誘導が出来ていないのかのどちらかだと考えています。研究サンプルは1日齢のひよこで一次抗体はmouseをホストとする鶏に交差をもつもの、二次抗体はgoat anti mouseなので試薬の問題は無いと考えられます。
気になっているのは抗体反応の際にTritonやTweenを使うところで細胞膜破壊の有無による神経発色の程度差、そして実際の蛍光観察ではプロトコールより少しでも逸脱すると発光が全く得られなくなるのか、そうであればどこが最重要な部分なのかなどです。それ以外にも本プロトコールでおかしいところや神経発色における最良のプロトコールなどがあればご指摘お願いします。
 
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(無題) 削除/引用
No.1670-3 - 2009/12/03 (木) 00:24:00 - TS
だいたいダブりますが、
・固定時間が長いような。。。10分くらいで大丈夫では?
・PermeabilizationのTriton濃度が高すぎです。。。0.1-0.2%で。
・Permeabilizationの後、一応、Washを入れたらどうでしょう。
・乾燥はしない方がよいでしょう。
・DAPIは、二次抗体といっしょにいれたらどうでしょう(改善案です)。

(無題) 削除/引用
No.1670-2 - 2009/12/02 (水) 23:57:23 - み
>[Re:1] パグさんは書きました :
> 手順としては
>
> PBS(−)で洗浄(5min×3)
***このwashは別にいらないと思う。分オーダーなんて必要ない。
まあ1回リンスで良い。初代神経培養細胞は弱いでしょ。

> 4℃の2%パラホルムアルデヒドでインキュベート(30min)
> ↓
> PBS(−)で洗浄(5min×3)
> ↓
> ドライヤー(冷風)で完全に風乾
***乾燥なんて普通するかなあ。凍結切片を乾燥するのとダブってるような・・・。このステップいらない。

> ↓
> PBS(−)で洗浄(5min×1)
> ↓
> 3%TritonX-100 in PBS(−)でインキュベート(5min)
***3%って濃いなあ。穴開けるだけでしょ。0.1%で良い。

> ↓
> 3%goat serum in PBS(−)でブロッキング(60min)
> ↓
> 一次抗体反応(4℃, O/N)
>    0.05%Tween20 in PBS(−)
>    3%goat serum
> neurofilament68(総量の1/800)

***抗体は本当に染められるものなのかなあ。

> ↓
> 0.05%Tween20 in PBS(−)で洗浄(10min×3)
***抗体反応後のwashは別に界面活性剤いらんと思うけど、まあ入れておいても良い。

> ↓
> 二次抗体反応(室温,3h)
>    PBS(−)
>    BSA(1mg/ml) 総量の1/1000
>    3%goat serum
> 5%Tween20 in PBS(−)
>    Alexa488
***5%Tweenって濃いなあ反応するのかなあ。0.05%Tweenとか0.1%Tx-100で良い。

> ↓
> 0.05%Tween20 in PBS(−)で洗浄(10min×3)
> ↓
> 以降はDAPI染色をしてカバーガラスへ封入しています。

***ひよこから採取したneuronを何日培養してるのですか?
また、その期間でneurofilament抗原が本当に発現するのですか?
ひよことその抗体扱ったことないのが自信もってコメントできない部分ですが、以上が免染プロトコールで気になった箇所です。

神経細胞の蛍光抗体方法 削除/引用
No.1670-1 - 2009/12/02 (水) 20:07:17 - パグ
はじめまして。現在誘導神経細胞の蛍光抗体反応をしているのですがあまり上手く検出されません。もし詳しいプロトコールをお知りの方がいたら教えてもらえないでしょうか。

手順としては

PBS(−)で洗浄(5min×3)

4℃の2%パラホルムアルデヒドでインキュベート(30min)

PBS(−)で洗浄(5min×3)

ドライヤー(冷風)で完全に風乾

PBS(−)で洗浄(5min×1)

3%TritonX-100 in PBS(−)でインキュベート(5min)

3%goat serum in PBS(−)でブロッキング(60min)

一次抗体反応(4℃, O/N)
   0.05%Tween20 in PBS(−)
   3%goat serum
neurofilament68(総量の1/800)

0.05%Tween20 in PBS(−)で洗浄(10min×3)

二次抗体反応(室温,3h)
   PBS(−)
   BSA(1mg/ml) 総量の1/1000
   3%goat serum
5%Tween20 in PBS(−)
   Alexa488

0.05%Tween20 in PBS(−)で洗浄(10min×3)

以降はDAPI染色をしてカバーガラスへ封入しています。蛍光観察の際は核染色はされていることから実験手法がおかしいのかただ神経への誘導が出来ていないのかのどちらかだと考えています。研究サンプルは1日齢のひよこで一次抗体はmouseをホストとする鶏に交差をもつもの、二次抗体はgoat anti mouseなので試薬の問題は無いと考えられます。
気になっているのは抗体反応の際にTritonやTweenを使うところで細胞膜破壊の有無による神経発色の程度差、そして実際の蛍光観察ではプロトコールより少しでも逸脱すると発光が全く得られなくなるのか、そうであればどこが最重要な部分なのかなどです。それ以外にも本プロトコールでおかしいところや神経発色における最良のプロトコールなどがあればご指摘お願いします。

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