はじめまして。現在誘導神経細胞の蛍光抗体反応をしているのですがあまり上手く検出されません。もし詳しいプロトコールをお知りの方がいたら教えてもらえないでしょうか。
手順としては
PBS(−)で洗浄(5min×3)
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4℃の2%パラホルムアルデヒドでインキュベート(30min)
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PBS(−)で洗浄(5min×3)
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ドライヤー(冷風)で完全に風乾
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PBS(−)で洗浄(5min×1)
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3%TritonX-100 in PBS(−)でインキュベート(5min)
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3%goat serum in PBS(−)でブロッキング(60min)
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一次抗体反応(4℃, O/N)
0.05%Tween20 in PBS(−)
3%goat serum
neurofilament68(総量の1/800)
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0.05%Tween20 in PBS(−)で洗浄(10min×3)
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二次抗体反応(室温,3h)
PBS(−)
BSA(1mg/ml) 総量の1/1000
3%goat serum
5%Tween20 in PBS(−)
Alexa488
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0.05%Tween20 in PBS(−)で洗浄(10min×3)
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以降はDAPI染色をしてカバーガラスへ封入しています。蛍光観察の際は核染色はされていることから実験手法がおかしいのかただ神経への誘導が出来ていないのかのどちらかだと考えています。研究サンプルは1日齢のひよこで一次抗体はmouseをホストとする鶏に交差をもつもの、二次抗体はgoat anti mouseなので試薬の問題は無いと考えられます。
気になっているのは抗体反応の際にTritonやTweenを使うところで細胞膜破壊の有無による神経発色の程度差、そして実際の蛍光観察ではプロトコールより少しでも逸脱すると発光が全く得られなくなるのか、そうであればどこが最重要な部分なのかなどです。それ以外にも本プロトコールでおかしいところや神経発色における最良のプロトコールなどがあればご指摘お願いします。 |
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