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(無題) 削除/引用 No.1666-11 - 2009/12/04 (金) 14:03:40 - デヴィ おお様 ありがとうございます。 トランスフェクションを最近始めたばかりで勉強不足でした。 論文を探してみようと思います。 どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1666-10 - 2009/12/04 (金) 13:32:11 - amurita issoさん コメントありがとうございます。 一応細胞の元気がなくなる２パッセージくらい前には新しいストックに移行するようにしてみているんです。（前に細胞の生きが悪いものを使って失敗しているので。） すぶりをするそぶりさん コメントありがとうございます。 実は自分でも吸着ロスが前から懸念材料としてあって（なのでトピックの中でもどんな素材のプレートやチューブが向いているかを聞いてみたわけですが，）今週テストしてみました。ポリスチレン素材を使用した場合はまったく発現が抑えられていませんでした！ Invitrogenの試薬やtransfection complex粒径の情報までありがとうございます。RNAiMAXは少量購入して試してみようかと思います。 ちなみに，私もリバーストランスフェクションを推してます。

(無題) 削除/引用 No.1666-9 - 2009/12/04 (金) 11:47:35 - おお >[Re:7] デヴィさんは書きました : > おお様 > > >[Re:3] おおさんは書きました : > > > 2度トランスフェクションする人もいるようです。 > > 横から失礼致します。 > > ２度トランスフェクションとはどのような間隔で行うのでしょうか？ > 実験によりけりだとは思いますけど、 48時間後というのが多いでしょうか、、、、 特にトランスフェクション試薬を入れっぱなしで培養していることが たいていです。 実験によってはsiRNAをコンフルに近い状態でトランスフェクションして24-48時間後 3ｰ5倍にsplitしてその翌日発現ベクターやレポーター遺伝子をトランスフェフェクション して、24-48時間後もう一度siRNAと言う事もあります。 結構2回トランスフェクションする方法はやられてますので、論文とか のマテメソなど細かく注意して読まれるとプロトコールが見つかると思いますけど。

トランスフェクション 削除/引用 No.1666-7 - 2009/12/04 (金) 10:51:21 - デヴィ おお様 >[Re:3] おおさんは書きました : > 2度トランスフェクションする人もいるようです。 横から失礼致します。 ２度トランスフェクションとはどのような間隔で行うのでしょうか？ トランスフェクションしてwashしたら即座に２回目のトランスフェクションを行うのでしょうか？ それとも翌日に行うのでしょうか？ 宜しく御願い致します。

(無題) 削除/引用 No.1666-6 - 2009/12/03 (木) 11:44:35 - すぶりをするそぶり siRNAのトランスフェクション試薬で、今まで取り扱ったことのあるものの中では Invitogen社のLipofectamineRNAiMAX が他のものとは桁違いに効率が良かったです。 http://www.invitrogen.jp/transfection/lipofectamineRNAiMAX.shtml#knockdown AmbionのsiPORT NeoFX/Amineとの比較はしたことがありませんが、 一度試しても良いのではないのでしょうか。 文章を読んで思ったのですが、コンプレックスの実験器具への吸着ロスを疑っていますでしょうか？ 私もコンプレックスの希釈系列をつくって、用量依存性を見ようとしたら まるでノックダウンが観察されなかった経験があり、 希釈系列をつくるためのピペッティング中に、 吸着ロスでコンプレックスが消失したのではないかと思っています。 ちゃんとした確認実験はおこなっていないのですが、 コンプレックスの粒径を測定すると、粒径1~10μmの沈殿体でした。 しかも、脂質の塊であると予想されます。 プラスチックチップやチューブによく吸着するんだろうなーと。 この点、Invitorogen社が推奨しているリバーストランスフェクションは 理にかなった実験方法ではないかと。 >リバーストランスフェクションでは、複合体はウェル内で調製し、 >その後、細胞と培地を加えます。 >フォワードトランスフェクションでは、細胞はウェル中にプレートし、 >翌日トランスフェクション混合液を別に調製して加えます。

(無題) 削除/引用 No.1666-5 - 2009/12/02 (水) 16:34:12 - isso 細胞のcell cycleが活発でなければ、SiRNAの取り込みも悪く、落ちがわるいんではないでしょうか？細胞種にも結構よるのでは?

(無題) 削除/引用 No.1666-4 - 2009/12/02 (水) 14:51:19 - amurita tmさん コメントありがとうございます。 コントロールに使っているGAPDHが50%しか落とせないんです。 実際にいろいろ試された方の意見はかなり助かります。 もっとほかの会社のも検討してみた方がいいのかな・・・ ありがとうございます。 おおさん コメントありがとうございます。 確かにそうですね，細胞名も明記しておくべきですね。 細胞はIRPTC (Immortalized Rat Proximal Tubule Cells) なんです。 文献も王道な細胞みたいにはたくさん出てこないです。 そんなに長く置いてみることや２回トランスフェクションするという方法は今まで頭になかったです。 もっと試すことの幅を広げてやってみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1666-3 - 2009/12/02 (水) 12:09:14 - おお 実際効率とかみてないですからね(方法なないことはないですけど)。 と言う事でトランスフェクションの試薬に書いてある通りです。 もし、使っている細胞がHeLaとか頻繁に使われる細胞で ないのなら、細胞の名前を提示してみれば情報が 集まるかもしれません。 同様にやってもよくきくものとききにくいものが あるのは事実です。ターゲットのタンパクの半減期 によっては96時間後とか長めに取った方がKDの効率が あがるそうです。 2度トランスフェクションする人もいるようです。

(無題) 削除/引用 No.1666-2 - 2009/12/02 (水) 12:02:48 - tm 自分の経験では，技術的な問題よりもsiRNA自体による部分（というかターゲット遺伝子による）が大きいと感じています．厳密に比較はしていませんが，結構おおざっぱにやっても落ちるsiRNAを使っていれば落ちます．例えばコントロールに使うGAPDのsiRNAなんかは，大抵95%以上落としてくれますが，自分の落としたい遺伝子に限ってどんなに厳密にやっても70%いくかどうかってこともよくあります．siRNAのメーカーをいくつも試したり，transfection試薬や方法もいくつか試しても，なかなか落ちないモノは落ちないってことも結構ありますね．3種類ぐらい混ぜてみたりとかするんですが，こう言う時ってなかなかきれいに落ちてくれなかったりして． ちなみにチューブは普通のPP製を使っています．混ぜるときはタッピングで，インキュベーション時間はプロトコル通りですが，結構適当でどちらかというと長め（最低必要なインキュベーション時間以上にするということ）でしょうか．気をつけているところといえば，試薬を用意するときに（チューブ壁面ではなく）培地中に直接入れることとか，細胞にかけるときにdropwiseで添加するとかぐらいです． なかなか落ちないヤツを落とせる技があるなら自分も知りたいです．

siRNA トランスフェクションに必要なトリックってありますか？ 削除/引用 No.1666-1 - 2009/12/02 (水) 11:15:38 - amurita 培養細胞にsiRNAをトランスフェクションさせているのですが、siRNAメーカー（Ambionのを使ってます。）のいう７０％以上まではmRNAレベルが落ちません。５０％くらいです。 よくある一般的なプロトコールには載っていないような技術的な知っておくべきトリックってありますか？ 例えば， -　トランスフェクションコンプレックスを作る際，チューブやプレートはポリスチレンまたはポリプロピレンどちらが向いているか -　混ぜるときはピペッティングで何回程度，もしくは指でタッピングする，ボルテックスもここはかけてもいいがこのときはだめ -　トランスフェクションコンプレックスフォーメーションの段階でのインキュベーション時間の厳密さ 等々，あるだけ教えてください。 ちなみに、使っているトランスフェクション試薬はAmbionのsiPORT NeoFX/Amine（まだ一つにしぼっていません。） 希釈に用いているメディウムはOPTI-MEMです。 よろしくお願いします。

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