全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1663-14 - 2009/12/03 (木) 17:48:41 - NU 結果を報告させていただきます。 洗浄時間をの回数と時間を増やし、膜の水切りを丁寧に行った結果、バックグラウンドをかなり下げることができました。 アドバイスしてくださった皆様、ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1663-13 - 2009/12/02 (水) 12:22:38 - c 手技や方法の問題というより、goat IgGを使うとどうしても避けられないことだと思いますのであまり悩まなくていいと思います。Goat 由来抗体は出来る限り使いたくないという人もいますから。 anti-goat IgG 2次抗体はバックグラウンドが高く、きれいなデータを得るのが難しいです。本当の理由は分かりませんが、おそらく牛の血清蛋白質（多分牛のIgG）と反応してしまうようなことだと思います。よってBSAの使用は避けた方がいい（グレードにより程度の差はあれIgGがどうしても混じってるとおもうので）しスキムミルクもよくないかもしれないです。解決法としてブロッキングは２次抗体の由来動物種の血清で行う（3ないし5％くらいでいいでしょう）。またはanti-sheep IgG２次抗体を使う（パーフェクトとまでは行きませんが、今よりはかなりましになります）。などがあります。 先輩の人は単にバックが上がる前に止めるようなイクスポーズの時間の調節とか、検出感度とかの調節のコツを知ってるというだけではないでしょうか。といあえず同じ方法でやってるならば、手技の優劣とか方法の誤りとかではないと思います。たとえばX線フィルムとかでやる場合だと、バンドのシグナルがかなり強ければ、フィルムと膜の接触時間をちょっと気をつけて手際よくいつもより短時間でやれば、慣れている人ならバックをある程度まで抑えることはできますから。

(無題) 削除/引用 No.1663-12 - 2009/12/02 (水) 12:11:20 - NU yt様 ブロッキング時間は90分なのでおそらく大丈夫だと思います。 nanasi様 入れ忘れはないと思います。 洗浄が不十分なようなので、「大量の洗浄バッファーを加えて10秒揺すり、液をしっかり捨てる」をやってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1663-11 - 2009/12/02 (水) 11:52:43 - nanasi 洗浄バッファーに先輩は界面活性剤を加えているけど、質問者さんは入れ忘れているということはないですか。 仮に５分×５回洗うプロトコールでしたら、私はその直前に「大量の洗浄バッファーを加えて10秒揺すり、液をしっかり捨てる」工程を入れています。

(無題) 削除/引用 No.1663-10 - 2009/12/02 (水) 11:31:42 - ｙｔ 専らスキムミルクを使ってて、BSAを使った経験は少ないのですが、何となくBSAはブロッキングを長時間やらないとバックグラウンドが高くなる傾向があるように思いました。 ブロッキング時間が書いてませんが、最低でも1時間はやった方が良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.1663-9 - 2009/12/02 (水) 11:09:59 - NU たくさんのご回答ありがとうございます。 ご意見を総括させていただくと、洗浄が不十分なのと検出液が過剰なのが原因のようですね。確かに今思えば洗浄がすこし甘かったように思います。 洗浄の徹底、二次抗体の反応時間、検出試薬の水切りを心がけ、もう一度チャレンジしてみます。

(無題) 削除/引用 No.1663-8 - 2009/12/02 (水) 09:57:56 - ばいや 検出時間が適切でない（長すぎる？）かも。 洗浄も可能性大。 洗浄の仕方などはどこが違うのかちゃんと見るのが一番。

(無題) 削除/引用 No.1663-7 - 2009/12/02 (水) 04:20:19 - あかね モモさんもご指摘されていますが、 Wash bufferを交換する際にしっかりと水切りすることによって、 メンブレンのムラが改善されることが多くあります。 過剰な二次抗体をしっかりwashして、bufferも次のwashに持ち込ませないように心がけることが、 綺麗なデータにつながります。

(無題) 削除/引用 No.1663-6 - 2009/12/02 (水) 04:11:27 - おお バンドは出ているような書き方なのであとはバック の問題見たいですね。やはり過剰な反応溶液が 邪魔してるんでしょうか、、、 OHPフィルムなどでサンドイッチにするといいかもしれません。 あとは抗体の希釈倍率をあげても(薄くしても)いい かもと思いましたが、ラボで統一しておくのも考慮した 方がいいかもしれませんので、周りと相談しながらやってください。

(無題) 削除/引用 No.1663-5 - 2009/12/02 (水) 02:53:21 - モモ Anti-goatの２次抗体は私も苦手です。 とりあえず、シグナルが強すぎるようなので、 ・２次抗体は４５分　（私はいつもこのあたりです） ・２次抗体の後の洗浄は十分に（私は１０分ｘ４回） ・洗浄の際はバッファーをできるだけきれいに取り除くように というやり方で大分ましになるんじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1663-4 - 2009/12/01 (火) 23:17:42 - AP >・検出試薬がメンブレン全体にかかっていないOR多すぎる このケースで、基質液が過剰で、びちゃびちゃしているときにそういうことが起こります。 発色系の基質と違って発光基質は反応産物がin situで沈着しませんので、拡散が自由に起こるほど液が過剰だと周囲に広がってしまいます。ラップする前に過剰の反応液をよくきる（メンブレンの縁をろ紙に当てるなど）点に注意してみてください。このような拡散を嫌がって、反応液で湿らせたろ紙の上にメンブレンを重ねて露光する人もいます。 また、発色液をメンブレンにあてる瞬間、速やかかつ均一に、全体に行き渡るようにしないと、最初にあたった部分が優先的に基質を吸収してそこだけ濃くなるということもあります。

(無題) 削除/引用 No.1663-3 - 2009/12/01 (火) 22:53:30 - Boston プロトコールはとても大事ですが、見て覚える事もとても大切です。先輩がどのようにしているのかを見るのが、一番の解決策だと思います。所属するラボに適した、無駄のない動きをしているはずです。くれぐれも話しかけたりして先輩のペースを乱さないように。

(無題) 削除/引用 No.1663-2 - 2009/12/01 (火) 22:24:04 - ~ 言葉の壁は大変ですね。 ジャスチャーや絵を描いたりして、がんばって意思の疎通を図ってください。 そこまで先輩にお願いできるのであれば、 先輩に途中までやってもらって、残りを貴方がやる、 途中まで貴方がやって、残りを先輩にやってもらう で、問題点が明確に出来ると思います。 なんとなく、検出試薬をかけた後に、余分な液を切るのが甘いような気がします。 液がたくさん残ると発光するようで、はさんでいるフィルムのムラと同じパターンにムラが生じるのを見たことがあります。 これが原因であれば、先輩の実験で検出まで終わったメンブレンを貰って、 貴方がもう一度検出試薬をかけて検出してみれば分かると思います。

ウエスタンブロットのバックグラウンドが非常に高い 削除/引用 No.1663-1 - 2009/12/01 (火) 21:56:50 - NU 先月から実験を始めたバイオ実験の新米です。 現在、ウエスタンブロットのブロッキング、抗体反応および検出の段階で実験がつまずいており、アドバイスをいただきたいです。 研究室の先輩とともに行っているのですが、まったく同じ膜抗体、ブロッキング剤、洗浄バッファーを用いても、私が実験を行うと非常に高バックグラウンドな結果になってしまい解析ができません。 かろうじてバンドらしいものは見えるのですが、濃く黒いむらに覆われてしまいます。むらはバンドの存在するところ中心に非常に広域に広がってしまっています。 状況をもう少し説明します。 SDS-PAGE、転写を私が行った後、先輩にブロッキング・抗体反応および検出を行ってもらうと問題なく検出できます。しかしこの後、私が同一メンブレンを洗浄、抗体除去、洗浄、ブロッキング、一次抗体反応、洗浄、二次抗体反応、洗浄、検出という流れで実験を行うと必ず失敗します。 先輩がSDS-PAGE、転写の段階まで行い、私がブロッキング・抗体反応・検出を行っても失敗します。 このためSDS-PAGEと転写に問題があるとは考えにくいです。 試薬等は以下のものを用いていますが、すべて先輩と同様のものを用いるためこれら自体に問題はないと思われます。希釈濃度も同じです。 膜：PVDFメンブレン ブロッキング：2%BSA 一次抗体：Pro-COL1A2(N-18;sc-8785,goat IgG) 二次抗体：Mouse anti-goat IgG-HRP 検出試薬：Pierce Western Blotting Substrate(イメージング装置を用いて検出) 自分なりに問題点を考えてみましたが、 ・一次、二次抗体の反応時間が長すぎる(それぞれ90分で行っています) ・二次抗体後の洗浄が不十分 ・検出試薬がメンブレン全体にかかっていないOR多すぎる という程度しか思いつきませんでした。 経験不足なのと先輩と言葉の壁があるためうまく意思疎通が図れず困っています。 何かほかに考えられる点や注意点がありましたらぜひご教授ください。

全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---