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(無題) 削除/引用 No.1659-14 - 2009/12/04 (金) 10:32:04 - 通りがかり オリゴの質は大丈夫ですか？ 以前同僚が同じような実験で非常に苦労していて、オリゴを作り直したらあっさり大量のコロニーが出たことがあります。

(無題) 削除/引用 No.1659-13 - 2009/12/04 (金) 10:15:53 - オリゴクローニング おお様 アドバイスをいただき、ありがとうございます。 >>ライゲーションの直前にアニーリングを済ませたオリゴを >>40-50度で温めて末端同士の付着とかを解除してやるとか >>するともしかしたらうまくいくのかなあって漠然と >>思ってます。 >先述のats様にもご指摘いただいたのですが、 >ligationの直前に50℃、1min→急冷（氷上）したものを >本日トランスフォーメーションする予定でいます。 >これで上手くいってくれれば、非常にありがたいのですが、 >また明日に結果をご報告させていただければと思います。 一晩以上プレートを置いておいたのですが、 結局、コロニーが生えてくることはありませんでした。 残念ですが、他の可能性を考えてみたいと思います。 >もし余裕があるようでしたら、プラスミドとオリゴを混ぜてから変成して >ゆっくり温度を下げてみてはどうでしょうか? 制限酵素処理し、精製したプラスミドと2つのオリゴをligationに用いる モル比で混合、アニーリング処理した後、ライゲーションを行うと いうことですね。一度チャレンジしてみたいと思います。 >塩濃度とかマグネシウム濃度とかそのた金属イオンを使ってオリゴのRNAで >思ったような構造をつくる人もいますので、いろいろ加えて条件を >探してもいいかもしれませんが、下手すれば泥沼かもしれません。 少し文献を調べてみようと思います。 情報をいただき、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1659-12 - 2009/12/04 (金) 09:51:16 - コンピ この手の質問でまず提示したほうが良い（すべき）情報の一つとして、コンピテンシーが有ると思います。（勿論それだけが問題とは限らない訳ですが） 私自身同様のコンストラクトの作成を何度かしましたが全く取れないといった経験はこれまではありません。（勿論インサートやベクター、ligation kit 色々違うの比較が難しいのですが。） やけにコロニーが少ない時はまずコンピテンシーを疑いますし、そういう時は総じてタイターが落ちてます。 チェックしましたか？

(無題) 削除/引用 No.1659-11 - 2009/12/04 (金) 07:54:09 - モモ クローニングしたいDNAの配列そのものに問題があったりしませんかね？ 同じオリゴ同士がくっついたり、ヘアピンを作ったりして、うまく狙い通りにアニーリングしてないってことがあるのかなぁ、と思いました。 これを確認するには、アニーリング前の２種類のオリゴをそれぞれと、アニーリングした後のオリゴを電気泳動しないといけないので、ちょっと面倒ですが。

(無題) 削除/引用 No.1659-10 - 2009/12/04 (金) 01:11:53 - おお >[Re:7] オリゴクローニングさんは書きました : > >アニーリングのあと電気えいどうとかで確認できないかなぁ、、、 > > 一度、1 colonyだけ目的のものが取れているので、 > 全くアニーリングが上手くいっていないとは考えていないのですが、 > 上記検討で上手くいかない場合は一度流してみることも > 検討したいと思います。 従来思ったような2本鎖のDNAができていたら、1000以上はコロニーが取れるはずの方法ですので1個しかできなかったというのが怪しいと思っている点です。 もし余裕があるようでしたら、プラスミドとオリゴを混ぜてから変成して ゆっくり温度を下げてみてはどうでしょうか? 塩濃度とかマグネシウム濃度とかそのた金属イオンを使ってオリゴのRNAで 思ったような構造をつくる人もいますので、いろいろ加えて条件を 探してもいいかもしれませんが、下手すれば泥沼かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1659-9 - 2009/12/02 (水) 17:26:43 - オリゴクローニング クロコ様 ご返答、ありがとうございます。 >リン酸化されていないオリゴに変えた方がよいのでは。 実はリン酸化されていないオリゴでも同じような検討を 行ってみたのですが、結果は変わりませんでした。 >また、ゲルから抽出する際にUV当てすぎの可能性もあります。 UVの照射には常に注意を払っているのですが、 正直なところ、現時点以上のスピードアップは なかなか難しいというのが現状です。

(無題) 削除/引用 No.1659-8 - 2009/12/02 (水) 14:59:43 - クロコ リン酸化されていないオリゴに変えた方がよいのでは。 また、ゲルから抽出する際にUV当てすぎの可能性もあります。

(無題) 削除/引用 No.1659-7 - 2009/12/02 (水) 08:59:24 - オリゴクローニング おお様 ご返答を頂き、ありがとうございます。 >もしかしたら、オリゴの末端同士がアニーリングして >ライゲーションの邪魔してるのかなぁとか、 >つかってるオリゴ自体が色々な構造をとるのかなぁとか >色々考えたりもしますが、、、 確かに用いている配列は繰り返し配列を含むため、 実験開始当初から、その辺りは危惧していました。 ただ、論文で報告はされているので、何か些細なことが 原因でクローニングに失敗しているものと考えています。 >ライゲーションの直前にアニーリングを済ませたオリゴを >40-50度で温めて末端同士の付着とかを解除してやるとか >するともしかしたらうまくいくのかなあって漠然と >思ってます。 先述のats様にもご指摘いただいたのですが、 ligationの直前に50℃、1min→急冷（氷上）したものを 本日トランスフォーメーションする予定でいます。 これで上手くいってくれれば、非常にありがたいのですが、 また明日に結果をご報告させていただければと思います。 >アニーリングのあと電気えいどうとかで確認できないかなぁ、、、 一度、1 colonyだけ目的のものが取れているので、 全くアニーリングが上手くいっていないとは考えていないのですが、 上記検討で上手くいかない場合は一度流してみることも 検討したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1659-6 - 2009/12/02 (水) 02:53:02 - おお そういえば私も一度この手のことをやったような気がします。 さほど難しい印象はなかったです。 もしかしたら、オリゴの末端同士がアニーリングして ライゲーションの邪魔してるのかなぁとか、 つかってるオリゴ自体が色々な構造をとるのかなぁとか 色々考えたりもしますが、、、 ライゲーションの直前にアニーリングを済ませたオリゴを 40-50度で温めて末端同士の付着とかを解除してやるとか するともしかしたらうまくいくのかなあって漠然と 思ってます。 アニーリングのあと電気えいどうとかで確認できないかなぁ、、、

(無題) 削除/引用 No.1659-5 - 2009/12/01 (火) 21:54:50 - オリゴクローニング tm様 ご返答いただき、ありがとうございます。 >自分もここ最近で数十個クローニングしていますが，ほぼ全部うまくいって>います．特に問題になるようなステップはなさそうですが，こう言うときは>一つずつ確認していくのがいいのではないでしょうか？primerの制限酵素サ>イトの配列が正しいかもう一度確認してみるとか．ベクターがちゃんと両方>の酵素で切れているのかとか． ご指摘いただいたように一つずつ確認しているつもりではありますが、 上手くいかないということはきっと何かを見落としているのだと思います。 今一度、各工程を見直して見ようと思います。 ちなみに制限酵素サイトの配列は問題ありませんでした。 ベクターも毎回、Sac1, Kpn1単独でリニアライズされているのを 確認していますし、self ligationが起きていない時点で 両酵素で切れているものと考えています。 >自分のやっている系と違う点をあげてみますと，まずprimerのアニーリング>はprimerを希釈しないで（100μM）5μLぐらいずつセンス・アンチセンスを>等量混ぜて95℃3分から適当に室温まで冷ましています（サーマルサイクラ >ーは使わずに適当にやってます）．その後必要ならリン酸化しておきます． アニーリング時のprimer濃度も100μM〜100nMと何点か振ってみました。 各濃度でトータルボリュームも振ってみたのですが、 初めの質問にあります条件の時のみ、1 colonyだけ得られたというのが 現状です。 ベクターはゲル抽出はせずに切った後はエタ沈だけで済ませています（脱リン酸化するときは酵素と一緒にSAP加えてます）．ligationは，モル比1:3ぐらいになるようにして，TaKaRaのMighty Mixで25℃5分だけです．４℃ O/Nでやったことないですね．これでコロニーはイヤと言うほど生えてきますよ．insertは30〜50bpぐらいでやってます． ligationは室温、5minでもできるものではありますが、 温度と反応時間を振った企業側のデータを見ますと 4℃, O/Nが最も効率が高いことが示されていたので、 このようなプロトコルを採用しました。 ちなみに自分も初めは室温、5minという条件からスタートし、 その後温度、反応時間をいろいろ振ってみましたが、 コロニーを得られなかったというのが現状です。

(無題) 削除/引用 No.1659-4 - 2009/12/01 (火) 19:23:18 - tm 自分もここ最近で数十個クローニングしていますが，ほぼ全部うまくいっています．特に問題になるようなステップはなさそうですが，こう言うときは一つずつ確認していくのがいいのではないでしょうか？primerの制限酵素サイトの配列が正しいかもう一度確認してみるとか．ベクターがちゃんと両方の酵素で切れているのかとか． 自分のやっている系と違う点をあげてみますと，まずprimerのアニーリングはprimerを希釈しないで（100μM）5μLぐらいずつセンス・アンチセンスを等量混ぜて95℃3分から適当に室温まで冷ましています（サーマルサイクラーは使わずに適当にやってます）．その後必要ならリン酸化しておきます． ベクターはゲル抽出はせずに切った後はエタ沈だけで済ませています（脱リン酸化するときは酵素と一緒にSAP加えてます）．ligationは，モル比1:3ぐらいになるようにして，TaKaRaのMighty Mixで25℃5分だけです．４℃ O/Nでやったことないですね．これでコロニーはイヤと言うほど生えてきますよ．insertは30〜50bpぐらいでやってます．

(無題) 削除/引用 No.1659-3 - 2009/12/01 (火) 18:21:22 - オリゴクローニング ats様 ご返答いただき、ありがとうございます。 >ライゲースを加える前に、ベクター＋インサート混合液を37(〜50)℃ 1分加>熱・急冷してみてください。これはインサート同士のアニールをはがす効果>があります。 早速、50℃, 1min→氷上の条件で処理し、試してみたいと思います。 >また、モル比は、3倍・10倍・30倍・100倍も試してください。 3倍〜50倍までは一度試してみたのですが、上記熱処理の工程を 加えていなかったため、再度3〜100倍の条件で振って 試してみたいと思います。 本日、O/Nでligation反応を行うため、 明後日colonyが生えてきたかどうかの報告を させていただきたいと思います。 どうぞ宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.1659-2 - 2009/12/01 (火) 15:29:56 - ats ライゲースを加える前に、ベクター＋インサート混合液を37(〜50)℃ 1分加熱・急冷してみてください。これはインサート同士のアニールをはがす効果があります。 また、モル比は、3倍・10倍・30倍・100倍も試してください。

短鎖dsDNAオリゴクローニング 削除/引用 No.1659-1 - 2009/12/01 (火) 12:16:36 - オリゴクローニング いつも拝見させていただいております。 表題の通り、オリゴクローニングが上手くいきません。 何方かご教授をいただければ、幸いに存じます。 条件は以下のとおりです。 �@受託合成でリン酸化した50塩基ほどのセンス鎖、アンチセンス鎖を 100nMになるようTNE buffer中に調整し、これを等量づつ混合、 アニーリング（95℃、10min反応後、25℃まで1℃/1minのスピードで 下げていく） →アニールした際、両端がSac1とKpn1 siteの切断面を 持つように設計しています。 �A事前にSac1-Kpn1 double digestion→ゲル抽したベクター50ngに 対し、モル比にして10倍量になるようTNE bufferで希釈したインサートを ligation（PromegaのLigaFast Rapid DNA Ligation System使用,4℃でO/N） �BDH5a（TOYOBO）にトランスフォーメーション（ligation productは E.coliの1/10以下） この方法で1度だけ、プレートに1 colonyだけ生えてきて、 目的のものが取れましたが、その後は同じ条件あるいは条件を振っても （アニーリングの際の濃度、インサートとバックボーンのモル比、 ligationの温度、反応時間など）まったくコロニーが得られません。 ルーチンで系を確立し、他のオリゴでも行っていきたいため、 より効率のよい条件を模索しているのですが、上記のように 1度できたものでも（1 colonyだけなので、できたといって いいのかわかりませんが）、現在では全く上手くいかない状況で 困っております。 何方かご教授をいただければ、幸いです。 どうぞ宜しくお願い致します。

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