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(無題) 削除/引用 No.1659-34 - 2009/12/08 (火) 20:51:56 - モモ Ｉ社のオリゴでしたか・・・ まあ、きちんと各社を比較したわけではないですが・・・

(無題) 削除/引用 No.1659-33 - 2009/12/07 (月) 10:59:09 - オリゴクローニング ばいや様 アドバイスありがとうございます。 >オリゴは100µMになるように純粋で溶解したほうが・・・。 >必要ならそれを小分けして凍結保存。 >使用に応じて希釈・buffer調整を行って。 オリゴは100μMと10μMでMilli-Q水に溶解して、 -20℃にストックしています。 アニーリング時にTNE bufferで初めに質問させていただいた 濃度で希釈し使用しています。 >オリゴをリン酸化をしていない場合、ベクターはリン酸化したままですよね？ >ちなみに私はオリゴにリン酸化はしない人です。 ベクターはdouble digestionをしているため、 self ligationは起こらないものと思い、 脱リン酸化処理等はしていません。 >オリゴをリン酸化したものとしていないものを試しているので確率はさらに低いと思いますが、業者の作り間違いというのもあります（間違いでなくても失敗だとおもうが）。私はまず合成の配列ミス、ベクターの切断のミス、業者の合成ミスの順番で疑います。ただ、今回普通のオリゴとちょっと違うから・・・。だから既製品のオリゴでない限り、合成ミスはありうると思っています。 今一度確認してみたいと思います。 あと、私はligationのときはなるべく水でDNAを調製して、bufferはligationに合わせています。オリゴをアニールするときは塩が少し含まれてしまうけど・・・。 AP様にもご指摘いただきまして、アニールする時の塩が 多少含まれてしまいますが、現在は水でインサートを希釈して 検討を行っております。

(無題) 削除/引用 No.1659-32 - 2009/12/07 (月) 09:21:37 - ばいや 直接関係ないが、気になったことで。 オリゴは100µMになるように純粋で溶解したほうが・・・。 必要ならそれを小分けして凍結保存。 使用に応じて希釈・buffer調整を行って。 オリゴをリン酸化をしていない場合、ベクターはリン酸化したままですよね？ ちなみに私はオリゴにリン酸化はしない人です。 オリゴをリン酸化したものとしていないものを試しているので確率はさらに低いと思いますが、業者の作り間違いというのもあります（間違いでなくても失敗だとおもうが）。私はまず合成の配列ミス、ベクターの切断のミス、業者の合成ミスの順番で疑います。ただ、今回普通のオリゴとちょっと違うから・・・。だから既製品のオリゴでない限り、合成ミスはありうると思っています。 あと、私はligationのときはなるべく水でDNAを調製して、bufferはligationに合わせています。オリゴをアニールするときは塩が少し含まれてしまうけど・・・。

(無題) 削除/引用 No.1659-31 - 2009/12/05 (土) 01:07:25 - オリゴクローニング AP様 ご教授いただき、ありがとうございます。 >１．TNE bufferで二重鎖オリゴを調製しているために、ligation反応に過剰のNa+が持ち込まれて、ligationを阻害しているのではないか。 >一価カチオンはT4 ligaseの反応を阻害することが知られています。SalI消化などで高塩濃度の状態のDNAはバッファー交換してからligationにもっていけなんてことは、よくいわれていたものです。PEG存在下ではまたちがった挙動をしめしたりするそうなの一概にはいえないですが（10% PEG存在下だとNa+があった方がligationが起こりやすいとか。古いNARに論文があって、たしかTAKARAのカタログではそれに基づいてNaCl濃度およびPEG濃度の検討実験が載っていました）。 >オリゴのように鎖長が短く、濃度も高い条件でハイブリッド形成するときには必ずしも塩濃度を高くする必要はないようです（普段はTEとか10 mM Tris-Clでやっちゃっています。純水でやっていた同僚もいました）。安全のために、少なくとも二重鎖になったオリゴを希釈するときは水でいいんじゃないでしょうか。 大変勉強になります。 本日検討を行ったものに関しては早速、 希釈を水で行ってみました。 他にもいろいろと条件を変えていますが、 上手くいくといいです。 >2. 二重消化のベクターで脱リン酸化する必要がないなら、オリゴの方の末端リン酸化は必須なのだろうか。二重鎖オリゴの濃度が過剰になるようにしているし、末端リン酸化されていればオリゴ同士で重合する方が優先的に起こるはずですね。特に高塩濃度かつPEG存在下では重合化が促進されるとされています（あ、リン酸化しなくてもうまくいかなかったと返信がありましたか。それにしても、理屈からいうと、、、）。 二量体や三量体も取れたら、それも材料として使ってみたいと思い、 初めリン酸化したものから検討を行っていたのですが、 リン酸化していないものでも今のところ全く上手くいっていない というのが現状です。 >3. 特に長いオリゴの場合は合成エラーが含まれる確率は結構あるし、オリゴの品質やメーカーの影響は大きいと思います。でも、合成エラーならランダムなはずなので、すべて、あるいは大部分の分子で、付着末端の配列がいっせいにおかしくなっているとは考えにくいかなあ。昔は発注がFaxで、オペレータが入力ミスということはありましたが、さずがに今はないでしょうね。内部にランダムな欠損や置換があったとしても、heteroduplexになるだけで、ligation/transformationにはそれほどインパクトはないような気がします（もちろんmutationをもった産物がとれても困りますが）。 メーカーはinvitrogenを利用しています。 HPLC精製でお願いしているので、それなりに高純度のものを 提供していただいていると思うのですが、 （添付データのHPLCのピークはとてもきれいです。） 正直それ以上のことはわかりません。 ちなみに、一個得られたクローンに関してはシークエンス解析から 置換・欠損といったものはなく、目的のものが得られていました。

(無題) 削除/引用 No.1659-30 - 2009/12/05 (土) 00:37:13 - オリゴクローニング ザンギ様 >何百種類もプラスミドを扱ってるとコロニーが少なかったり、菌の増殖が >悪かったりすることに出くわします。 >僕はDH系の株を普段はクローニングに使っていますが、困った時にはとりあえずインビトロジェンのMach1を使ってみます。 >コロニーの大きさが揃わなかったり、増えるのが速すぎたり（？）しますけど、 >相性問題回避にはお勧めです。 >余談ですが、相性っていうとオカルトチックな印象がありますが、プラスミド >上の配列と宿主のmRNAの何かの配列と干渉して生育阻害がかかるんではないかと >想像しています。 >pUC系のプラスミドはコピー数が多いですから。 ご教授、ありがとうございます。 プラスミドと宿主との相性については今まで、 そうしたケースに出くわしたことがありませんでしたし、 あまり考えたこともありませんでした。 今用いているコンピがなくなったら、 一度、Mach1を購入してみて、試してみたいと思います。 ただ、過去に制限酵素処理しないintactのプラスミドを 形質転換した際、他の関係ないプラスミドと比較し、 大差なくトランスフォーマントが得られました。 コンピテンシーは計算していないのですが、 宿主との相性が悪い場合、他のプラスミドより見た目からも 明らかにその効率が悪くなりそうに感じるのですが、 その辺りはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1659-29 - 2009/12/04 (金) 22:18:19 - AP あんまりクリティカルなことではないかもしれませんが、ちょっと頭に浮かんだことを、 １．TNE bufferで二重鎖オリゴを調製しているために、ligation反応に過剰のNa+が持ち込まれて、ligationを阻害しているのではないか。 一価カチオンはT4 ligaseの反応を阻害することが知られています。SalI消化などで高塩濃度の状態のDNAはバッファー交換してからligationにもっていけなんてことは、よくいわれていたものです。PEG存在下ではまたちがった挙動をしめしたりするそうなの一概にはいえないですが（10% PEG存在下だとNa+があった方がligationが起こりやすいとか。古いNARに論文があって、たしかTAKARAのカタログではそれに基づいてNaCl濃度およびPEG濃度の検討実験が載っていました）。 オリゴのように鎖長が短く、濃度も高い条件でハイブリッド形成するときには必ずしも塩濃度を高くする必要はないようです（普段はTEとか10 mM Tris-Clでやっちゃっています。純水でやっていた同僚もいました）。安全のために、少なくとも二重鎖になったオリゴを希釈するときは水でいいんじゃないでしょうか。 2. 二重消化のベクターで脱リン酸化する必要がないなら、オリゴの方の末端リン酸化は必須なのだろうか。二重鎖オリゴの濃度が過剰になるようにしているし、末端リン酸化されていればオリゴ同士で重合する方が優先的に起こるはずですね。特に高塩濃度かつPEG存在下では重合化が促進されるとされています（あ、リン酸化しなくてもうまくいかなかったと返信がありましたか。それにしても、理屈からいうと、、、）。 3. 特に長いオリゴの場合は合成エラーが含まれる確率は結構あるし、オリゴの品質やメーカーの影響は大きいと思います。でも、合成エラーならランダムなはずなので、すべて、あるいは大部分の分子で、付着末端の配列がいっせいにおかしくなっているとは考えにくいかなあ。昔は発注がFaxで、オペレータが入力ミスということはありましたが、さずがに今はないでしょうね。内部にランダムな欠損や置換があったとしても、heteroduplexになるだけで、ligation/transformationにはそれほどインパクトはないような気がします（もちろんmutationをもった産物がとれても困りますが）。

大腸菌のストレイン 削除/引用 No.1659-28 - 2009/12/04 (金) 20:01:52 - ザンギ 何百種類もプラスミドを扱ってるとコロニーが少なかったり、菌の増殖が 悪かったりすることに出くわします。 僕はDH系の株を普段はクローニングに使っていますが、困った時にはとりあえず インビトロジェンのMach1を使ってみます。 コロニーの大きさが揃わなかったり、増えるのが速すぎたり（？）しますけど、 相性問題回避にはお勧めです。 余談ですが、相性っていうとオカルトチックな印象がありますが、プラスミド 上の配列と宿主のmRNAの何かの配列と干渉して生育阻害がかかるんではないかと 想像しています。 pUC系のプラスミドはコピー数が多いですから。

(無題) 削除/引用 No.1659-27 - 2009/12/04 (金) 17:23:41 - オリゴクローニング モモ様 アドバイスを頂き、ありがとうございます。 >以前同僚がＩ社にオリゴを注文してもらったことがあったのですが、 >注文と違うオリゴ（１塩基足りない！）が送られてきたことがありました。 >その同僚は、クローニングして何度シークエンスしてもdeletionが入っていてしばらく困っていましたが、オリゴを別の会社に注文しなおしたらあっさり解決しました。 >私はそれとは別の会社（ＩＤＴ）を利用していますが、今まで特にこまったことはありません。 検討項目としては後ろの方になりますが、 再合成も視野に入れたいと思います。 >それと、余計なお世話かもですが、リン酸化を外注していらっしゃるようですが、自分でＰＮＫを使ってやったほうがとても経済的ですよ。 オリゴでのクローニングが初めてであったため、 できるだけ作業工程を少なくしたいと考えていたのですが、 系が確立後はそのような形で行っていきたいと思います。 ご助言ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1659-26 - 2009/12/04 (金) 15:34:10 - オリゴクローニング おお様 アドバイスをいただき、ありがとうございます。 >モル比はいじりましたか?10倍なら多分問題ないと思いますが >過剰に入れるとインヒピッションかかったりしますからね >(コロニーの数が減るということです)。1:1位でも >十分かもしれません。 先日アドバイスをいただきましたligation前の50℃→急冷処理した プロトコルでは1:3, 1:10, 1:30, 1:100で検討を行いました。 50℃→急冷処理しないプロトコルではもっと細かく振っているのですが、 1:1は行っていないため、入れてみたいと思います。 >でもザンギさんが書いているようにコンピを変えてみるのも >確かに得策かもしれませんけどね(理論的なことに >くわえて漠然とした相性もありますから、、、) コンピも残り少ないので、次は別のものを購入して 検討を行いたいと思います。 >UVも確かに気になるところですが、完全に切れているか >ライゲーションごのバックグランドを十分抑えられるのなら >えいどうの必要はないかもしれません。 ゲル抽は行わずに精製し、切れ残りを考慮にいれて、 ネガコンをおき、現在検討を行っております。

(無題) 削除/引用 No.1659-25 - 2009/12/04 (金) 15:15:28 - オリゴクローニング 774様 ご返答いただき、ありがとうございます。 >以前同じような方法でshRNA発現レトロウイルスベクターを作成しました。 >ヘアピン構造を取る可能性もあったのですが、割と簡単にとれました。 >100uMオリゴDNAを5ulずつ混ぜて、95℃30秒→72,37,25℃2分ずつ。 >これを100倍希釈した物を1ulとベクター50ngをライゲーションさせる。 >大腸菌はDH5αを使いました。 自分のプロトコルと照らし合わせ、その違いを 熟考させていただく材料にさせていただきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1659-24 - 2009/12/04 (金) 15:02:27 - オリゴクローニング ザンギ様 ご返答を頂き、ありがとうございます。 >僕の思いつきのサジェスチョンは >「クローニングしにくい断片でも、ホストを変えるとあっさりとれることがある」ってことでしょうか。 検討項目の一つに入れさせていただきたいと思います。 >失礼なものいいかもしれませんが、ご本人のスキルはどれくらいのレベルでしょうか。 >最初の質問記事を読んでの感想は、よく勉強されて基本をおさえた実験をプランしているけど、丁寧すぎないか？っていうところです。 正直なところ、スキルのレベルがどのくらいにあるかは 私自身どのように判断、お答えしたらよいのか迷うところではありますが、 今までこうした遺伝子工学的な実験を中心に行ってきたわけではなく、 必要な時に行っていた程度なので、経験としては浅いと思います。 実質的な期間にしますと３年くらいでしょうか。 方法等もこの手のプロにしっかり付いて教わったというわけではなく、 自分でいろいろと勉強をして我流で行っているところが大きいと思います。 コロニーがほとんどできないときって、インサートよりはホストかベクターの問題のような気がします。 コンピテンシーの確認とライゲーションのポジコンはどうなってるんでしょうか？ コンピテンシーはコンピ様の疑問に返答させていただきましたが、 問題はないのではと考えています。 ライゲーションのポジコンはオリゴ以外のクローニングで 今までクローンが取れなかったことがなかったため、 おいていなかったのですが、これからはおくように 検討を進めていきたいと思います。 >それから、実験ではベクターの切り出しは必ずしも必要でないように思います。 >UV照射の時間を最短にするには、照射してるときにはゲルに切れ込みで印を つけておいて、切り出す作業は明るい場所でやるといいです。 >ベクターなので大量にDNAがある場合にはEtBｒ染色すると肉眼で赤く見えますしね。 クロコ様にもご指摘いただき、後に自分でもいろいろと 調べていたのですが、可能性を上げるためにも 現在はゲル抽は行わない方向で精製し、 ligationを行う方向で検討しています。

(無題) 削除/引用 No.1659-23 - 2009/12/04 (金) 12:45:32 - オリゴクローニング ばいや様 ご返答ありがとうございます。 >いつもならオリゴをアニールしてクローニングできている人が、今回できないって条件で話をすると、やっぱり繰り返し配列は気になります。 PCR productのクローニングやプラスミド間の切った貼ったなどは 今まで何回か行っておりましたが、このような短鎖でのオリゴの アニーリングからクローニングまでは今回初めてになります。 >可能ならば繰り返し配列以外の部分を長くして、クローニングした後、制限消化なりして目的のものを作るのはどうでしょう？分子内結合や分子間でもずれたものは出来にくくなると思うのですが・・・。 ご指摘いただいた正確に末端の突出部分が形成されているか というところはずっと気になっているところではありました。 先ずは皆様からいただいたアドバイスをもとに一つ一ついろいろと 検討を重ねてみて、最終手段としてそのようなオリゴの合成も 考えてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1659-22 - 2009/12/04 (金) 12:09:40 - モモ オリゴの質について横レスですが。 以前同僚がＩ社にオリゴを注文してもらったことがあったのですが、 注文と違うオリゴ（１塩基足りない！）が送られてきたことがありました。 その同僚は、クローニングして何度シークエンスしてもdeletionが入っていてしばらく困っていましたが、オリゴを別の会社に注文しなおしたらあっさり解決しました。 私はそれとは別の会社（ＩＤＴ）を利用していますが、今まで特にこまったことはありません。 それと、余計なお世話かもですが、リン酸化を外注していらっしゃるようですが、自分でＰＮＫを使ってやったほうがとても経済的ですよ。

(無題) 削除/引用 No.1659-21 - 2009/12/04 (金) 11:49:16 - オリゴクローニング 通りがかり様 ご返答ありがとうございます。 >オリゴの質は大丈夫ですか？ >以前同僚が同じような実験で非常に苦労していて、オリゴを作り直したらあっさり大量のコロニーが出たことがあります。 オリゴはメーカーのクローニング推奨のHPLC精製したものを 用いており、普段は-20℃に保存しております。 いろいろ検討を重ねた後、上手くいかないようであれば また作り直すことも考えたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1659-20 - 2009/12/04 (金) 11:37:31 - おお 確かに標準のプロトコールできちっりとやっているのに 何にも生えなかったりとかちょっと気持ち悪いですね。 場合によってはそれなりにバックが出て(まあ50以下かなぁ) 片っ端から拾って全部ダメとかという方があり得るパターン かもと思ったりしますが、そうでないところが、、、 モル比はいじりましたか?10倍なら多分問題ないと思いますが 過剰に入れるとインヒピッションかかったりしますからね (コロニーの数が減るということです)。1:1位でも 十分かもしれません。 コンピも市販の物をそのまま購入して使われているようでしたら、 保存状態に問題がない限りしっかりしたコンピテンシーを もっているでしょうし、、 でもザンギさんが書いているようにコンピを変えてみるのも 確かに得策かもしれませんけどね(理論的なことに くわえて漠然とした相性もありますから、、、) UVも確かに気になるところですが、完全に切れているか ライゲーションごのバックグランドを十分抑えられるのなら えいどうの必要はないかもしれません。 切り出す場合は私は下に銀紙ひいて、幅のあるウエルをつかってバンドの ごく端っこだけUV当てたりして切り出してます。 確かここでどなたかに教えてもらった方法だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1659-19 - 2009/12/04 (金) 11:31:05 - オリゴクローニング コンピ様 ご返答いただき、ありがとうございます。 >この手の質問でまず提示したほうが良い（すべき）情報の一つとして、コンピテンシーが有ると思います。（勿論それだけが問題とは限らない訳ですが） >私自身同様のコンストラクトの作成を何度かしましたが全く取れないといった経験はこれまではありません。（勿論インサートやベクター、ligation kit 色々違うの比較が難しいのですが。） >やけにコロニーが少ない時はまずコンピテンシーを疑いますし、そういう時は総じてタイターが落ちてます。 >チェックしましたか？ コンピテントセルは自作ではなく、市販のものを用いております。 実はこの実験とは別に他の遺伝子のクローニングも このコンピテントセルを用いて実験を行っておりまして、 昨日に用いた時点でも大量のトランスフォーマントを得られていますので、 （厳密に計算はしておりませんが、全量をまくとコロニーを拾うのが 困難なほどです。）問題はないと考えています。

(無題) 削除/引用 No.1659-18 - 2009/12/04 (金) 11:30:57 - 774 以前同じような方法でshRNA発現レトロウイルスベクターを作成しました。 ヘアピン構造を取る可能性もあったのですが、割と簡単にとれました。 100uMオリゴDNAを5ulずつ混ぜて、95℃30秒→72,37,25℃2分ずつ。 これを100倍希釈した物を1ulとベクター50ngをライゲーションさせる。 大腸菌はDH5αを使いました。 オリゴクローニングさんが既に検討された条件と大差ないので役に立たないかもしれませんが・・・

(無題) 削除/引用 No.1659-17 - 2009/12/04 (金) 11:10:37 - オリゴクローニング モモ様 ご返答ありがとうございます。 >クローニングしたいDNAの配列そのものに問題があったりしませんかね？ >同じオリゴ同士がくっついたり、ヘアピンを作ったりして、うまく狙い通りにアニーリングしてないってことがあるのかなぁ、と思いました。 >これを確認するには、アニーリング前の２種類のオリゴをそれぞれと、アニーリングした後のオリゴを電気泳動しないといけないので、ちょっと面倒ですが。 現在電気泳動で確認することも考えています。 ただ、研究室でアクリルアミドの電気泳動がここ数年ワークして いないようなので、これから試薬類を発注して検討することになり、 結果を得るまでに少し時間がかかってしまいそうです。

(無題) 削除/引用 No.1659-16 - 2009/12/04 (金) 10:54:36 - ザンギ 僕の思いつきのサジェスチョンは 「クローニングしにくい断片でも、ホストを変えるとあっさりとれることがある」 ってことでしょうか。 失礼なものいいかもしれませんが、ご本人のスキルはどれくらいのレベル でしょうか。 最初の質問記事を読んでの感想は、よく勉強されて基本をおさえた実験 をプランしているけど、丁寧すぎないか？っていうところです。 コロニーがほとんどできないときって、インサートよりはホストかベクターの 問題のような気がします。 コンピテンシーの確認とライゲーションのポジコンはどうなってるんでしょうか？ それから、実験ではベクターの切り出しは必ずしも必要でないように思います。 UV照射の時間を最短にするには、照射してるときにはゲルに切れ込みで印を つけておいて、切り出す作業は明るい場所でやるといいです。 ベクターなので大量にDNAがある場合にはEtBｒ染色すると肉眼で赤く見えますしね。

(無題) 削除/引用 No.1659-15 - 2009/12/04 (金) 10:34:11 - ばいや >[Re:7] オリゴクローニングさんは書きました : > 確かに用いている配列は繰り返し配列を含むため、 > 実験開始当初から、その辺りは危惧していました。 > ただ、論文で報告はされているので、何か些細なことが > 原因でクローニングに失敗しているものと考えています。 いつもならオリゴをアニールしてクローニングできている人が、今回できないって条件で話をすると、やっぱり繰り返し配列は気になります。 論文報告ではどうなのかも分かりませんが、相当苦労して偶然出来た1つを載せたのかもしれません。 可能ならば繰り返し配列以外の部分を長くして、クローニングした後、制限消化なりして目的のものを作るのはどうでしょう？分子内結合や分子間でもずれたものは出来にくくなると思うのですが・・・。

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