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(無題) 削除/引用 No.1651-18 - 2010/08/24 (火) 20:19:37 - A 私が低温で蛋白質を発現させる時は18度で行っています。一般的に この温度が大腸菌が増殖できなくなる温度と言われているからです。 16度というのも見たことあります。この辺りの1-2度が蛋白質発現に どれぐらい影響するかはわかりません。発現時間ですが知り合いで 最長一週間発現させているのを見たことがあります（実験の事情で M9最小培地だったと思います）。この辺りはそれぞれの発現系 や条件により大きく異なるでしょうから一つ一つ条件検討する しかないですね。中年さんがおっしゃるようにIPTGの分解はそれほど 起こらないと思いますが一週間の様な長時間の発現を行う場合は 何処かのタイミングで再度加える必要があるかもしれません。 これも条件検討の対象かと思います。

(無題) 削除/引用 No.1651-17 - 2010/08/24 (火) 14:04:53 - けい >[Re:16] 中年さんは書きました : > "IPTGの消費"をどういう意味で仰っているか分かりませんが、IPTGは代謝されませんよ。 すみません。ＩＰＴＧではなく、抗生物質として使っているAmpの間違いでした。プラスミドの脱落によってタンパクが発現してこなくなるのではと思いました。 > いずれにせよ、発現条件の最適化はやってみるしかないのでは？ 確かにそうかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1651-16 - 2010/08/24 (火) 12:52:13 - 中年 "IPTGの消費"をどういう意味で仰っているか分かりませんが、IPTGは代謝されませんよ。非酵素的な分解もされにくい化合物だと思います。 いずれにせよ、発現条件の最適化はやってみるしかないのでは？

(無題) 削除/引用 No.1651-15 - 2010/08/24 (火) 11:42:45 - けい 古いトピにすみません。 私はいまpETベクター＋BL21でタンパクを発現させています。 培養は37度で行い、培養液を冷やしてからIPTGを添加し、温度を下げて培養しています。 25度培養では可溶性に発現したタンパクを得られなかったため、15度で培養しています。 少し気になったのですが、みなさんは低温で培養するとき、何日ぐらい培養されていますか？2日以上培養しても、IPTGの消費により発現量が変わらないのではと思いまして・・・

大腸菌は増えるのにプラスミドが取れない 削除/引用 No.1651-14 - 2010/04/15 (木) 15:33:55 - なるた 現在インビトロジェンのChampion pET Directional TOPO Expression Kitsを使ってpET101/D-TOPOベクターへのある遺伝子のクローニングを試みています。 マニュアルに従ってLigation→TOP10へTransformation後、カルベニシリン100ug/mL入りLBプレート上で生育させました。 コロニーは問題なく多数生育し、カルベニシリン100ug/mL入りLB液体培地で一晩培養後、プラスミドを抽出しました。菌は十分増えていました。 が、アルカリSDS法でもQIAGENのQuickLyse Kitでもプラスミドが取れません。 泳動するとクリアな１本のバンドではなくスメアなブロードバンドがうっすら、という程度です。 どなたか解決策をご存じでしたらご教授下さい。

(無題) 削除/引用 No.1651-13 - 2009/12/02 (水) 12:25:57 - E.coli 低温じゃないと発現しないって言うのは、少し語弊がありますが。 いろんなGFP融合タンパク質を作成したことがありますが、大体において低温培養での誘導が安定的に発現していました。温度に関しては場合によって違うので、多少条件検討をしたほうが良いかと思いますが、私は基本的に発現誘導後16℃で24時間とか、あるいは24℃でOver nightとかで試してみます。 前培養もなるべく37℃では培養しないで、30℃や28℃で行い、誘導直前には培養液を氷上で30分間静置します。 GFPの場合、試す価値は大いにありますが、融合した相手によっては必ずうまく行くというわけではないのであしからず。

みなさまありがとうございます。 削除/引用 No.1651-12 - 2009/12/02 (水) 11:00:23 - som ありがとうございます。 発現誘導の時間が 低温度じゃないと発現しないとのことですが 下げるとしたら何度まで下げるものですか？

(無題) 削除/引用 No.1651-11 - 2009/12/01 (火) 11:06:32 - ザンギ 融合たんぱくの発現がゼロではないのなら、大腸菌がプラスミドを落としてる んではないですか？ 液体培養のスケールを大きくするとプラスミドを失くした菌が増えてくる ことがよくあります。 JM109ならプラスミドの回収もできますよね？ 通常通り獲れますか？ 解決法は色々あると思いますが、過去ログに沢山のってますよ。

(無題) 削除/引用 No.1651-10 - 2009/12/01 (火) 08:43:00 - E.coli GFP融合タンパク質を大腸菌で発現させる場合は、低温培養条件下での誘導でないと発現量がなかなか増えなかったような気がします。 一応、参考までに。

ありがとうございます。 削除/引用 No.1651-9 - 2009/11/30 (月) 19:53:35 - som >APさん すみませんが、明日確認して返信いたします。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1651-8 - 2009/11/30 (月) 19:44:15 - AP >しかし、大腸菌量は得られるのですが、十分な発現量が得られません。 と書いているように、当たり前に大腸菌が殖えているなら、産物の毒性の影響ではないとみました。毒に当たると、コロニーからしてあんまり出てこないとか、生えてもべちゃっと広がって健康そうでないとか、液体培養で殖えが異常に遅かったり、十分長時間振って濁ってきてもうっすら透けて見えたり、debri（溶菌した死骸）があったり、なにからしら兆候があるものです。 しかも、非誘導時の発現抑止がゆるい、JM109を使用した宿主ベクター系を使っていますのでleakyな発現がかなりあるはずで、毒性があれば増殖がかなり困難になっているはずだと思います。 たぶん、ベクターの設計、仕上がりの問題だと思いますが、その辺の情報は出せますか？

すみません 削除/引用 No.1651-7 - 2009/11/30 (月) 16:47:10 - som >CJさん タンパク質を融合させていないとは、購入したGFPの配列に、タンパク質の配列をインサートしていないという意味です。 つまり、購入したプラスミドをそのまま発現に用いたと言う意味です。 すみません。

すみません 削除/引用 No.1651-6 - 2009/11/30 (月) 16:45:10 - som

(無題) 削除/引用 No.1651-5 - 2009/11/30 (月) 16:14:34 - CJ たんぱく質を融合させていないプラスミドは発現する。 ってのはどういう意味なのでしょう？

ご返答ありがとうございます。 削除/引用 No.1651-4 - 2009/11/30 (月) 16:06:11 - som >Pumpkinさん ありがとうございます。 JM109は一般的ではないのですね。 >とおりがかりさん catalog.takara-bio.co.jp/PDFFiles/PT2040-1_j.pdf によると、JM109で発現が行われています。 また、先ほど書き忘れたのですが、 タンパク質を融合させていない、プラスミドは十分量発現します。

(無題) 削除/引用 No.1651-3 - 2009/11/30 (月) 14:57:59 - とおりかがり 毒性云々よりもその発現プラスミドに対してJM109は適切なホストですか。 発現ベクターの種類くらい明らかにしておいたほうが有意義な議論になるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1651-2 - 2009/11/30 (月) 14:50:01 - Pumpkin もっと一般的な蛋白質発現用大腸菌を使われてみたらいかがでしょうか。BL21株とか。 >発現させようとしているプラスミドに毒性があるのではないか 「発現させた融合タンパク質に毒性があるのではないか」ですよね。プラスミドDNAが毒性を発揮するとは思えません。

毒性に強い大腸菌 削除/引用 No.1651-1 - 2009/11/30 (月) 14:42:08 - som いつも参考にさせて頂いております。 さっそく質問です。 ただいま、Competent high E.coli JM109を用いてGFP融合タンパク質の発現条件の検討を行っています。 しかし、大腸菌量は得られるのですが、十分な発現量が得られません。 バンドでは確認できるのですが、続く実験系には不十分です。 また、溶液も緑色になっていなく、ほぼ透明です笑。 IPTG濃度、発現誘導時間を振りましたが、結果は得られませんでした。 そこで、発現させようとしているプラスミドに毒性があるのではないかと考え、大腸菌を変えてみようと思います。 なにかおすすめはありますか？ ほぼ、素人なので、お手柔らかにお願いします。。。

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