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(無題) 削除/引用 No.1649-16 - 2009/12/02 (水) 09:16:29 - ALV おお様 >前にも少し書きましたが、ビスの濃度を下げたり >アクリルアミドの濃度を下げたりと言う事も >考えられるかなあとおもいました。 >もしDNAを加えてあグッているとか思えるなら >サンプルのプレパレーションか反応を工夫した方が >いいかもしれません。 >うまく行くか分かりませんがまずtRNAとか加えて >遠心かフィルターかましてから、反応するとか、、、、 >と言うのはたいていこの手のあっせいではプローブが過剰 >になりますから、フリーのDNAが全く見えないのは >少しきになります。 ゲルの組成に関しては，全く気にしていませんでした。 今はinvitrogenのレダレーションゲルを使用しています。 室温でbindingさせたあと，15000rpmで5分間遠心してから上清を泳動していますが，なかなか思うようなバンドは見えないです。 crudeの蛋白に目的の蛋白がどれほどの量含まれているのか分からないため，probeの量を固定して蛋白だけを段階希釈しています。この条件で泳動すると，蛋白を入れないウェルのフリーを100として，高濃度蛋白のレーンはほぼ０，流れるレーンでも40くらいでしょうか。 尚，フリープローブが見られるレーンでもバンドのシフトは認められませんでした。

(無題) 削除/引用 No.1649-15 - 2009/12/02 (水) 01:41:26 - おお >[Re:6] ALVさんは書きました : > おお様 > > 泳動に時間がかかるのは予想していたのですが， > crude蛋白を使用しているせいかウェルにプローブがよく残り > フリーのプローブさえ見えない時があります。 > そのためbinding buffer の条件さえ整えられないのが悩みどころです。 みなさんが指摘されていますように、望みは ありそうですね。デタージェントをサンプルや ゲルに入れるなどすでに指摘がありますが、 有効かもしれません。現実問題フリーのDNAはウェル からどれくらい移動しますでしょうか。 前にも少し書きましたが、ビスの濃度を下げたり アクリルアミドの濃度を下げたりと言う事も 考えられるかなあとおもいました。 もしDNAを加えてあグッているとか思えるなら サンプルのプレパレーションか反応を工夫した方が いいかもしれません。 うまく行くか分かりませんがまずtRNAとか加えて 遠心かフィルターかましてから、反応するとか、、、、 と言うのはたいていこの手のあっせいではプローブが過剰 になりますから、フリーのDNAが全く見えないのは 少しきになります。

(無題) 削除/引用 No.1649-14 - 2009/12/01 (火) 19:14:19 - ALV タカ様 ありがとうございます!! 参考にさせていただきたいと思います。 僕も，キットの選択などでグーグルで検索してしまいます…。 結構，マイナーな方法も拾えるので助かっています。NP-40は全く見つけられませんでしたが…。 茶色様 ご指摘ありがとうございます。 教官には冷温室でするようにと言われましたが，うちのラボにはないので氷水に泳動槽を突っ込んで泳動していました。 温度も重要なファクターなので，条件を不利ながらトライしてみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1649-13 - 2009/12/01 (火) 15:09:30 - 茶色 ウエルにスタックするのは、私もいい傾向だと思います。 キャリアDNAを十分入れてみてください。（１０倍、１００倍、１０００倍など） 見逃しがちなのは、電気泳動を温度で４度、常温　３７度でやってみるのはいいかも？？しれません。

(無題) 削除/引用 No.1649-12 - 2009/12/01 (火) 14:07:58 - タカ ALVさん． 複数のDNA結合たんぱく質によるゲルシフトは、 3つのタンパクを別々に精製してきて混ぜました． 3つのうち1つは、特異性が低かったのでdIdCといった コンペティターが使えない状況でした． 3つとも単体でプローブの別々の場所に 結合するのはわかっていたんですが、 互いに結合を助けたり、相互作用があるのではないかと 思って、実験をおこないました． プローブの長さは225bpで、5末RIラベルです． で、まず、単体のタンパクがかろうじて結合できる タンパク濃度で実験を行ったんですが、 プローブのほとんどすべてがウェルに アグる感じになってしまいました． タンパクの濃度を下げると今度は全くシフトしなくって、 NP40とかへパリンとかをbinding bufferに入れると、 2本のバンドがシフトバンドとして現れて、 タンパク濃度と組み合わせによって どの組み合わせがどんな相互作用をしてるのかとかが わかった次第です． crudeじゃないのであんまり参考にはならないかもしれませんね． ただ、核抽出液とかでもウェルに詰まる現象は良く見られる みたいで、その時はNP40を加えたりゲルに入れたり するみたいです． 参考文献はちょっとすぐには出てこないです． ちなみに私はアブストに載らないようなメソッド関連の 論文検索にはグーグル先生を使ってます． freeのペーパーのマテメソが引っ掛かってくるので． まだまだ先は長いですが、面白そうな研究なので 頑張ってください．

(無題) 削除/引用 No.1649-11 - 2009/12/01 (火) 12:04:37 - ALV おお様 >ゲルシフトもプロモーター活性もこの手の実験には >欠かせないともいえるわけですから、両方やりながら >でてきたデーターをもとに、他の実験系を改善すること >もできますので、ゲルシフトで行き詰まっているとお感じでしたら >ほかにやれるところから攻めるのがいいかもとおもっています。 ありがとうございます。 そのあたり，実際に転写因子を検索している人とも話したのですが 他の方法でめどを立てるのもありかなと思っています。 最終的には結合から遺伝子発現まで見たいので考えてみたいと思います。 タカ様 ＞私は複数のタンパクをDNAに結合させる実験をしたことがあるのですが、 ＞その際にALVさんと同様にウェルに詰まってしまいました． ＞そこで、NP40やヘパリンを使うときれいに ＞複数のシフトバンドとして検出できたことがあります． ＞tritonを使った論文も見たことがあります binding buffer にNP40などを入れるのは初めて知りました。 ありがとうございます。 少し調べただけですが，市販されているキットにも含まれていることもあるようですね。 もう少し調べてみようと思います。 タカさんが複数の因子の結合を見られたときの状況など 教えていただけないでしょうか？（もし参考論文など有れば）

(無題) 削除/引用 No.1649-10 - 2009/11/30 (月) 15:16:33 - タカ ALVさん． �@DNAの長さとKmについて 誤解させてしまったようで申し訳ないです． 同じ特異的な配列（コア配列）を持つDNA断片を長めにとったのと 短めにとったのとでは長めにとった方が Kmが低いということです． �AウェルにDNAが残っている という文章を目にしました． これはきちんと結合している可能性があると思います． 私は複数のタンパクをDNAに結合させる実験をしたことがあるのですが、 その際にALVさんと同様にウェルに詰まってしまいました． そこで、NP40やヘパリンを使うときれいに 複数のシフトバンドとして検出できたことがあります． tritonを使った論文も見たことがあります． 頑張ってください．

(無題) 削除/引用 No.1649-9 - 2009/11/30 (月) 13:31:40 - おお >[Re:8] ALVさんは書きました : > おお様 > > ＞コアと仰っているのは、その領域でプロモーター活性が > ＞あるという解釈でしょうか? > 過去の文献や塩基配列の違いから，プロモーター領域全体 (300bp) のなかの150bpくらいに結合領域があると考えています。便宜的にコアと表現しましたが，過去の論文などでもこの領域に転写因子結合領域が集中しているようです。 > > 急がば回れということで，プロモーター活性を観る方がいいのでしょうか。 過去の文献から割出ということなので、何処まで信用できるのか とかいろいろあると思います。なのでこの辺の判断はやる人 次第かとも思えます。そこに集中しているということ なのでもしかしたら複数のタンパクという可能性も ありますし、熟考はされているとは思いますけどね。 どちらが先かという考えもあると思いますけど、 ゲルシフトもプロモーター活性もこの手の実験には 欠かせないともいえるわけですから、両方やりながら でてきたデーターをもとに、他の実験系を改善すること もできますので、ゲルシフトで行き詰まっているとお感じでしたら ほかにやれるところから攻めるのがいいかもとおもっています。

(無題) 削除/引用 No.1649-8 - 2009/11/30 (月) 12:36:43 - ALV おお様 ＞コアと仰っているのは、その領域でプロモーター活性が ＞あるという解釈でしょうか? 過去の文献や塩基配列の違いから，プロモーター領域全体 (300bp) のなかの150bpくらいに結合領域があると考えています。便宜的にコアと表現しましたが，過去の論文などでもこの領域に転写因子結合領域が集中しているようです。 急がば回れということで，プロモーター活性を観る方がいいのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1649-7 - 2009/11/30 (月) 12:07:53 - おお 手間かと思いますが、プロモーター活性でもう少し絞り込んで 行く方がいいかもと思いました。300bp全域にべっちゃりくっついて いるということはそんなにないだろうと思いますし。 コアと仰っているのは、その領域でプロモーター活性が あるという解釈でしょうか?

(無題) 削除/引用 No.1649-6 - 2009/11/30 (月) 11:32:56 - ALV おお様 ありがとうございます。 ＞長いプローブが難しいのは、ゲル上で移動度が遅すぎる ＞からだと思います。300bpでもご経験があるということでしたら、 ＞きっとゲルの%やT/Cを工夫したらできるかもしれないとも ＞思えるので、そのへんをアドバイスすればいいのではと ＞思いますが。 泳動に時間がかかるのは予想していたのですが， crude蛋白を使用しているせいかウェルにプローブがよく残り フリーのプローブさえ見えない時があります。 そのためbinding buffer の条件さえ整えられないのが悩みどころです。

(無題) 削除/引用 No.1649-5 - 2009/11/30 (月) 11:28:22 - ALV タカ様 ＞ポジコンがシフトしないのであれば、 ＞crudeがまずいのではないでしょうか？ ＞コンペティターを減らしてくっつくんなら、 ＞そこから特異性が出るように検討してはいかがでしょう？ 実は，ウイルスのプロモーター領域に結合する新たな分子を検索しています。 そのためポジコンがありません。 また，ソフトウェアでbinding　site を検索したのですが予想されるような領域が無く，プロモーター領域全域（300bp）EMSAで結合するような分子がないか観ていた状況です。 さすがに300ｂｐは長すぎるとおもい，そのうちコア領域だけ（約130bp）に短縮してトライしています。

(無題) 削除/引用 No.1649-4 - 2009/11/30 (月) 11:09:15 - おお >[Re:2] タカさんは書きました : > 何がうまくいかないのかわかりませんが、 > 基本的に短いよりか長い方が結合しやすい > （Kmが低くなる）です． Kmは特異的配列に依存するので長さだけで結合しやすい とはいえないと思いますけど、、、、 長いプローブが難しいのは、ゲル上で移動度が遅すぎる からだと思います。300bpでもご経験があるということでしたら、 きっとゲルの%やT/Cを工夫したらできるかもしれないとも 思えるので、そのへんをアドバイスすればいいのではと 思いますが。 非常に扱いにくくなるかもしれませんがPAGE4%ぐらいまでなら 実際やる事はありますね。

(無題) 削除/引用 No.1649-3 - 2009/11/30 (月) 11:03:15 - おお たしかに300は2本鎖だととくに長いですね。 一つはアガロースでやるてはあると思いますけど、 どうしてもゲルシフトでないといけませんか? DNA/RNAをレジンや96wウェルの底に固定して 目的のタンパクがトラップされるとか言う風なあっせい も考えられると思いますけど。 まあこの場合ターゲットに対する抗体がないと ちょっとできないかもしれません。 それかふっとプリントとかもやれるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1649-2 - 2009/11/30 (月) 11:00:04 - タカ 何がうまくいかないのかわかりませんが、 基本的に短いよりか長い方が結合しやすい （Kmが低くなる）です． ポジコンがシフトしないのであれば、 crudeがまずいのではないでしょうか？ コンペティターを減らしてくっつくんなら、 そこから特異性が出るように検討してはいかがでしょう？

長鎖プローブを用いたゲルシフトアッセイ 削除/引用 No.1649-1 - 2009/11/30 (月) 10:40:18 - ALV はじめまして。 150-300bp長のプローブを用いたゲルシフトアッセイを行っていますがなかなか良い結果が得られません。 一般的には数十bpのプローブを使用するとおもいますが，実験内容からこの長さ以下には削れません。 もし，このような実験内容であればどのような条件をくめばよいのでしょうか？ 皆様のご意見をお聞きしたいです。 尚，タンパクはニワトリの脳あるいはリンパ組織のクロード蛋白， ゲルシフトにはrocheのDIG EMSA kit， 泳動条件は 0.5×TBE，200V,1時間 です。

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