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(無題) 削除/引用 No.1647-19 - 2009/12/02 (水) 01:17:08 - おお >[Re:12] かえでさんは書きました : > > おおさん > ＞ハイグロで選択する場合は適切な細胞株に入れないとダメですよね > これは、ハイグロマイシンがタンパク質の合成を阻害するからという考え方ですか？ > いちどインビトロジェンのプロダクトマニュアルをよまれると いいかと思います。そのプラスミドにはハイグロマイシンを発現 させるためのプロモーターがありませんので、そのままではハイグロマイシンは 発現しません。

(無題) 削除/引用 No.1647-18 - 2009/12/02 (水) 00:54:36 - おお >[Re:15] かえでさんは書きました : > たんぱくさん、おおさん。何度も何度も詳しく回答していただき、ありがとうございます。とても勉強になります。 > > おおさん > ＞別のトランスポーターではだめですよ > これは、トランスポーターごとに一過性発現株や安定発現株で発現量が異なるということで理解してよろしいでしょうか。 マスの性質が分かっていればそれぞれのタンパクでcoverage など違うわけですから、検出しにくいタンパクもあると 思いませんか?

(無題) 削除/引用 No.1647-17 - 2009/12/01 (火) 22:45:55 - Boston まずは分画しないで、WB するのがよいかと思います。複数の方がアグっている可能性を指摘されていますし、膜に発現している保証は全くありません。あと、トランスファーする膜（PVDF、MC）やトランスファーバッファー（SDS、MeOH）をかえるだけで驚く程結果が異なります。ICH もトライしてみる価値があると思いますーエピトープがどこなのかに依りますが。 あと、トランスポーターとしての機能を検出して、発現を評価できないものでしょうか。この辺は素人なのでトンチンカンなコメントでしたら無視して下さい。

(無題) 削除/引用 No.1647-16 - 2009/12/01 (火) 17:05:07 - たんぱく 目的バンドサイズ以外の同じ位置にバンドの様子とか、 場合によってはsiの結果とか、えぴトーぷ部位とかを 総合することになろうかと思います。

回答ありがとうございます 削除/引用 No.1647-15 - 2009/12/01 (火) 14:14:17 - かえで たんぱくさん、おおさん。何度も何度も詳しく回答していただき、ありがとうございます。とても勉強になります。 おおさん ＞別のトランスポーターではだめですよ これは、トランスポーターごとに一過性発現株や安定発現株で発現量が異なるということで理解してよろしいでしょうか。 ということは、可能性の話になりますが、今回の私のトランスポーターは、「トランスポーター自身として発現させることのできる最大の発現量を発揮している。しかし、その最大の発現量があまりにも低く、検出できない」という可能性も考えられるのでしょうか？ また、同様に発現系を構築できないトランスポーターについてご存知でしたら教えていただけないでしょうか？ たんぱくさん ＞とりあえずそんなにたいした実験でもないので ＞1% Triton ＞2% Triton ＞2% Tween ＞2% NP40 ＞くらいで可溶性と沈殿をウエスタンしてみるかなぁ・・・。 ＞一過性発現で。 なるほど、この実験について調べてみます。 それと、すみません。先ほど「抗体は使っていません」と書きましたが、抗体は一度使いました。 HepG2、ACHNに一過性で導入した細胞からCrude Membraneを回収し、それをサンプルとしてWestern blotを行いました。このとき、Negative controlとして、HepG2、ACHNのwild typeから回収したCrude Membraneを使いました。その結果、一過性発現株、およびwild type両サンプルで、目的バンドサイズ付近にはバンドが検出できませんでした（HepG2、ACHN両細胞とも）。しかし、一過性発現株、wild type両サンプルで目的バンドサイズ以外の同じ位置にバンドが検出されました（HepG2、ACHN両細胞とも）。 このような場合、たんぱくさんでしたらこの抗体は使えないと判断しますか？ よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1647-14 - 2009/12/01 (火) 12:51:22 - おお >[Re:12] かえでさんは書きました : > おおさん > ＞少なくてもどれくらいの発現で、その系でどの程度検出できる > ＞か把握しておかないと難しいと思うのですが > これは、先輩が別のトランスポーターで安定発現株を構築した際のデータと比較し、ある程度把握しています。しかし現状では、LC-MS/MSでピークすら検出できていません。 別のトランスポーターではだめですよ。

(無題) 削除/引用 No.1647-13 - 2009/12/01 (火) 12:36:49 - たんぱく なやましい状態ですね。 データシートのフィグはあてになりませんから・・・。 とりあえずそんなにたいした実験でもないので、 1% Triton 2% Triton 2% Tween 2% NP40 くらいで可溶性と沈殿をウエスタンしてみるかなぁ・・・。一過性発現で。

回答ありがとうございます 削除/引用 No.1647-12 - 2009/12/01 (火) 11:07:40 - かえで TSさん、おおさん、たんぱくさん、Bostonさん。回答ありがとうございます。そして、返信が遅れてしまいすみません。 TSさん 転写開始部位からシークエンス解析を行ったのですが、フレームシフトは起こっていませんでした。 おおさん ＞少なくてもどれくらいの発現で、その系でどの程度検出できる ＞か把握しておかないと難しいと思うのですが これは、先輩が別のトランスポーターで安定発現株を構築した際のデータと比較し、ある程度把握しています。しかし現状では、LC-MS/MSでピークすら検出できていません。 ＞ハイグロで選択する場合は適切な細胞株に入れないとダメですよね これは、ハイグロマイシンがタンパク質の合成を阻害するからという考え方ですか？ たんぱくさん ＞まずはウエスタンあたりで、荒くぶんかくしてみるかな 購入した抗体のデータシートには、Western blotで目的バンドサイズ付近にバンドが検出されていました。しかし、私の所属している研究室には、この抗体の反応性を確認するためのポジティブコントロールがないので、まだ抗体を使っていません。このような状態であっても、ウェスタンするべきでしょうか？ Bostonさん ＞FLAG, HA タグをシグナルベプチド下流につけるのが ＞一番早いような気がします 勉強不足だったもので、タグの存在は知りませんでした。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1647-11 - 2009/12/01 (火) 09:54:56 - たんぱく ABCってたしかあんまりはっきりしたシグナル配列をもってなかったような。 違ったらごめんなさい。 タグつけるならC末かな。SDSPAGEの変性温度もあまりボイルすると そこであぐるかも。

(無題) 削除/引用 No.1647-10 - 2009/12/01 (火) 00:29:10 - Boston FLAG, HA タグをシグナルベプチド下流につけるのが、一番早いような気がします。膜に発現しているかどうかも分からない状態で LC-MS/MS に時間を費やすべきでないと思います。

(無題) 削除/引用 No.1647-9 - 2009/11/30 (月) 13:02:39 - おお >[Re:8] たんぱくさんは書きました : > 細胞内のどっかであぐってるのかもしれませんね。 > まずはウエスタンあたりで、荒くぶんかくしてみるかな、私なら。 > ABCの抗体ってあまりいい抗体がなかったように記憶していますので、 > 意外と手間取るかもしれませんが。 わたしも書かなかったのですがあグッているとかそういうのも 手伝っているかなぁとは思っていました。

(無題) 削除/引用 No.1647-8 - 2009/11/30 (月) 12:59:16 - たんぱく 細胞内のどっかであぐってるのかもしれませんね。 まずはウエスタンあたりで、荒くぶんかくしてみるかな、私なら。 ABCの抗体ってあまりいい抗体がなかったように記憶していますので、 意外と手間取るかもしれませんが。

(無題) 削除/引用 No.1647-7 - 2009/11/30 (月) 12:01:04 - おお トランスフェクションは10%ぐらいのDNA量のGFP発現ベクタ- をまぜて、GFPを蛍光で検出してだいたいなん%位の効率で 入ったか見積もれると思います。 どれくらいの効率がいいかは実験によりますが、この手の 実験でよく使うHEKとかHeLaなんかでは50%は確実に入ると おもいます。 目的のタンパクの発現はIHCかウエスタンで一度確認することを おすすめいたします。お使いのプラスミドはホモロガスリコンビネーション でハイグロマイシンが発現できるシステムになっていますね。 ハイグロで選択する場合は適切な細胞株に入れないとダメですよね。 それとTetのリプレッサーも入っていますから細胞株とかの コンビネーションをよく見ないと誘導されてないかもしれません。 そのままHEK(293)や293T、HeLa、HepG2などにトランジェントで 発現させるには大丈夫と思いますが、もし確認されていない ようでしたら、プロダクトマニュアルやテクニカルサポート で確認されるようにしたほうがよさそうです/

(無題) 削除/引用 No.1647-6 - 2009/11/30 (月) 11:48:32 - おお >[Re:5] かえでさんは書きました : > > タンパク発現確認は、LC-MS/MSを用いて行いました。このときサンプルは、一過性発現株のCrude Membraneを使いました。また、LC-MS/MSを用いたタンパク検出に用いたペプチドプローブ、チャネルはABCA8タンパクを検出可能ということを確認しました。 いきなりMSですか。。。。。定量性もないでしょうし、、、 それに内在性の物が発現していないという前提でも、MSで感度 よく(生理的に意味がない発現レベルで)ひっかかってきたら 結論が出なくなってしまいませんか? 少なくてもどれくらいの発現で、その系でどの程度検出できる か把握しておかないと難しいと思うのですが、、、

回答ありがとうございます 削除/引用 No.1647-5 - 2009/11/30 (月) 11:31:08 - かえで ytさん、Bostonさん。回答ありがとうございます。 ytさん ＞I guess more detailed description about your transfection protocol ＞would be helpful for viewers to give you appropriate advices. ご指摘ありがとうございます。トランスフェクションのプロトコールについてですが。 トランスフェクション前日に、10 cm dishに50%程度コンフルエントの細胞を、新しい10 cm dishに継代しました。この時、10 cm dish１枚当たり6×10^6個になるようにし、トランスフェクション当日に70〜90%コンフルエントになるようにしました。 トランスフェクション当日、HEK293は、DNA 12 μg、Lipofectamine2000 30 μL / 10 cm dish 1 plateで遺伝子導入を行いました。 HepG2，ACHNは、DNA 24 μg、Lipofectamine2000 60 μL / 10 cm dish 1 plateで遺伝子導入を行いました。また、遺伝子導入中（6時間）は、細胞を無血清培地のOpti-MEM1培地で培養しました。 遺伝子導入から6時間後、培地をDMEM（10% FBS without antibody）培地に交換しました。 遺伝子導入から48時間（Opti-MEMで6時間、DMEMで42時間培養）後、細胞を回収しました。 Bostonさん ＞どのようにしてタンパク質の発現を確認したのでしょうか タンパク発現確認は、LC-MS/MSを用いて行いました。このときサンプルは、一過性発現株のCrude Membraneを使いました。また、LC-MS/MSを用いたタンパク検出に用いたペプチドプローブ、チャネルはABCA8タンパクを検出可能ということを確認しました。 よろしくお願いします。

フレームシフトはチェックしましたか？ 削除/引用 No.1647-4 - 2009/11/30 (月) 11:26:06 - TS

(無題) 削除/引用 No.1647-3 - 2009/11/30 (月) 08:59:41 - Boston そうですね。例えば、どのようにしてタンパク質の発現を確認したのでしょうか。WB なのか？ICH なのか？使用した抗体はその用途で使えるものなのか？

(無題) 削除/引用 No.1647-2 - 2009/11/30 (月) 04:44:28 - yt I guess more detailed description about your transfection protocol would be helpful for viewers to give you appropriate advices.

細胞への遺伝子導入について教えてください 削除/引用 No.1647-1 - 2009/11/30 (月) 03:56:13 - かえで はじめまして 現在、膜タンパク質ABCA8の発現系を作成しているのですが、うまくいきません。 現状として、 (1)HEK293細胞で作成したABCA8安定発現株では、mRNAの発現は確認できるのですが、タンパクの発現が確認できませんでした。 (2)HEK293、HepG2、ACHNそれぞれの細胞を用いてABCA8一過性発現株を構築した際にも、タンパクの発現が確認できませんでした。（それぞれの細胞への遺伝子導入の条件は、報告されている条件で行いました） (1)、(2)で用いたベクターはpcDNA5/FRTです。 解決するための方法がございましたら、ご教授いただきたいです。 よろしくお願いします。

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