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(無題) 削除/引用 No.1636-9 - 2009/11/29 (日) 22:22:25 - shh kさん 　有難うございます。もし可能であれば使用していたキット名をお教えいただけないでしょうか。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1636-8 - 2009/11/29 (日) 21:57:18 - ｋ 経験者です。 BAC用のプラスミド抽出キットで抽出してください。 以上 フェノクロとかやる必要ないです。 倉ボーの抽出マシーンがあるならあれでいいです。

(無題) 削除/引用 No.1636-7 - 2009/11/27 (金) 18:10:36 - shh 皆さんありがとうございます ザンギさん 　すみません、アルカリSDSとフェノクロだけの今回の方法で plasmid をシークエンスした事はありません。この事も検討すべき事でした有難うございます ばいやさん 　制限酵素で切り出す事で手間がかかると現在想定しているのは量を集める点です。BAC は 200kbp の大きさで自分が切り出すバンドとして 10K ぐらいを想定しています。仮に 1 μg を完全消化すると、50 ng 程度は得られるはずですが、 BAC は O/N でも切りづらいというのを実感していまして。もともと miniprep で得られる量もそれほど多くないので、全体的に考えて量を集めるのが大変かなと思って書きました。 　BAC は今回初めて扱うので他の BAC でのシークエンスは経験がありません。BAC からの PCR 産物はシークエンスできます。 　plasmid をカラムで取った時の方が、アルカリSDS法と比べた時正確な値が得られている実感があったので、正確な濃度を知る事が出来るのでは書きました。 bacさん 　情報ありがとうございます。さっそく調べてみます。

(無題) 削除/引用 No.1636-6 - 2009/11/27 (金) 17:13:05 - bac Big Dye Protocols and NotesでGoogle検索して一番上に示されたところに有るプロトコールを参考にしてシークエンスできました。 BigDye ver1.1 　4マイクロリットル primer 30pmol BAC DNA 　1マイクログラム 100サイクルです。 BAC DNAの調整はUser-Developed Protocol: Isolation of BAC DNA using the QIAGEN® Plasmid Midi Kit . を参考にしました。

(無題) 削除/引用 No.1636-5 - 2009/11/27 (金) 16:56:44 - ばいや ちゃんとクローニングされていれば~さんの方法で問題ないと思いますが。 あと、制限消化による切り出しでもそんなに手間でもないような気もしますが。BACは使ったことがないので。量をたくさん使うのが大変なんでしょうか？ それとカラムを使って精製すれば何故濃度が正確なBACを調製できるのでしょうか？ ちなみにシークエンスのどこが良くないのでしょうか？プラスミドなら読めるのですか？他のBACは読めますか？

(無題) 削除/引用 No.1636-4 - 2009/11/27 (金) 16:50:43 - ザンギ フェノール抽出だと性制度や残留物の問題でシーケンスがうまくいかないことが あったように思います。 コピー数が少ないと大量に鋳型を加えたくなるので失敗しやすいようです。 同じ方法でプラスミドを抽出するとシーケンスはよめるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1636-3 - 2009/11/27 (金) 15:43:13 - shh 有難うございます PCR で遺伝子が BAC に挿入されているのは確認しています。 使用しているプライマーですが、 通常の plasmid にその遺伝子がある場合は読める事は分かっています。 Recombineering という方法を用いて PCR 産物を直接 BAC に導入したので、BAC のダイレクトシークエンスを行わないと、2回増幅したものをシークエンスしたという結果になってしまうので、正確性を期すためにもダイレクトシークエンスを行いたいのです。 言葉足らずで分かりづらいかもしれませんがよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1636-2 - 2009/11/27 (金) 09:28:40 - ~ プライマーがBACの配列に結合する場合、そのBACで実績があるものでしょうか？ プライマーがBACの配列の場合、データベースの配列と実際が異なっている場合には読みようがありませんので、親株で一度確認が必要でしょう。 インサートの配列の場合は、どのように入っているのかをこれから確認するわけですから、読めないのかプライマーが結合する部分が入っていないかは分かりませんよね。 挿入された場合、されなかった場合を確認できるようなPCRでチェックされていますでしょうか？ PCRで親株と挿入を区別できるようなPCRが出来るのであれば、そのPCR産物をダイレクトシークエンシングしてはいかがでしょうか。

BAC のシークエンスについて 削除/引用 No.1636-1 - 2009/11/27 (金) 04:04:23 - shh BAC に挿入した遺伝子のシークエンスを行っているのですが、上手く読めません。 基本的にアプライドバイオシステムの BigDye ver1.1 の巨大テンプレート用のプロトコールに従っています。テンプレートにはアルカリ-SDS法で調製した BAC をフェノクロを行ってから使用しています。Nanodrop で濃度は測定して、テンプレートの量は調整していますが、正確な値が出ていないんじゃないかと現在疑ってます。 シークエンスの結果はきれいなピークは見られず、全く読めいていないという状況です。 自分が考えている解決方法の一つはカラムを使ってテンプレートを調製する事です。そうすれば濃度が正確な BAC を調整でき、シークエンスに適量の BAC を使用できるのではと考えています。 もう一つは制限酵素処理をして、遺伝子を挿入したバンドのみをゲル抽出し、それをテンプレートにしようかと考えています。かなり手間は掛かりますが、BAC と通常の plasmid の最も大きな違いはサイズだと思ったので、この方法ならば上手く読めるのではないかと考えました。 BAC のシークエンス方法や自分が考えた解決法に対して、些細な事でもかまいませんので助言を頂ければ幸いです。よろしくお願いします。

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