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(無題) 削除/引用 No.1634-16 - 2010/06/25 (金) 18:11:13 - Kanata ゆきさん 結果を報告してくださってありがとうございます。 ドナーが原因だったんでしょうか？？そうなると、実験時にバイアスが かかりそうでちょっと気になりますね。 分化成功よかったですね。今後の実験の進展をお祈りします！

(無題) 削除/引用 No.1634-15 - 2010/06/22 (火) 14:16:46 - ゆき いろいろ試してみましたが、ドナーを変えたら上手くMDDCに分化できました!! 培養条件はあまり変えなくて、(サイトカイン濃度や培養するときの細胞濃度)、結局ドナーによって分化できるできないがあるのかな？

(無題) 削除/引用 No.1634-14 - 2009/12/01 (火) 11:01:31 - ゆき >Kanata様 ご意見、ありがとうございます。 その方法も考えていまして、FBSのロットをいろいろ試してみるときにヒトの血清やDC専用培地(SIGMA等)で培養してみようかと。 マウスのDCのときもはじめはいろいろ条件検討して確立しましたので、今回もいろいろ条件を変えていきたいと思います。アドバイス、ほんとにありがとうございました!!!! >FACS様 ご意見、ありがとうございます。 LPSの刺激はまだ行っていないのですが、1度だけ7日目にFACSにてCD1a、HLA-ABC、HLA-DR、CD80、CD86をみてみましたが、いずれのマーカー(CD1a以外)はlowでしたが、CD1aの発現は5～6%しかなかったです・・・。CD14はこのとき抗体がなかったのでできませんでした。 それからの実験ではDCの誘導ができていなく細胞は死んでしまいます。 FSC/SSCプロットでは細胞の集団がなく画面全体にdotが散らばっています。 >DC様 ご意見、ありがとうございます。 シャーレは細胞用できちんと付着する(コーティングされている)dishを使用しています。 このシャーレを使用してマウス骨髄細胞や他の接着細胞も付着することは確認済みです。

(無題) 削除/引用 No.1634-13 - 2009/12/01 (火) 10:13:30 - DC ふと思ったのですが・・・ マウスDCの誘導のクセで、ペトリディッシュに蒔き込んでるなんて事はないですよね・・・ マウスDCの誘導方法には組織培養用に蒔き込むものとペトリディッシュに蒔き込むものの二つのプロトコールがあるので・・・

(無題) 削除/引用 No.1634-12 - 2009/12/01 (火) 04:40:30 - FACS 疑問に思ったのですが、Day7のimmatureDC、LPS刺激後のday10のmatureDCの段階でFACSを流してみて、CD11ｃ、CD1a、HLADRの発現やCD14のdownregulationを見たり、FSC/SSCプロットでDCgate内にどの程度細胞がいるか見たことはあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1634-11 - 2009/12/01 (火) 02:33:02 - Kanata 同僚から聞いた話で、私自身は試していないと前置きしますが、 ヒトから血液を採取する際に、一部を血清の状態で保存し、それを培地（FBS-free)に加えて使用するとよい、という説もあるのだそうです。 この場合10センチシャーレに10mLの培地として、5%で500マイクロリットル添加する形になるでしょうか。 私の場合は血液センターから来たものを使っていたので血清を使えるわけもなく、FBS添加のRPMIでMFに分離させました。（DCだからといって違うとも思えないのですが） 私自身、ヒトPBMCからMFへの分化というごくごく普通のことがうまくいかず、論文を読み漁ったり人に聞いたりしてなんとか方法を確立しました。 焦らずにひとつひとつチェックしてみてください。いい結果が得られますように。

(無題) 削除/引用 No.1634-10 - 2009/11/30 (月) 22:59:17 - ゆき >DC様 ご意見、ありがとうございます。 FBSの可能性もありますか。 SIGMAにDC専用の培地があるみたいなの、1度試してみたいと思います。 ただ、同研究室の研究員の方がCD14で分離をしないでPBMCを播種したのち、接着細胞をGM-CSF、IL-4を含む培地で培養してCD1c Isolation kitを使用してDCの分離に成功しました(汗)ただ、細胞数が10^5オーダーでしたが・・・。 確かにマニュアルMACSでポジティブセレクションをすると細胞が痛む、死ぬなどちらほら聞きますが、マウスの骨髄由来DCはCD11cでポジティブセレクションをしても死にませんし、きちんとシャーレにも接着しています。ヒトだからだめってことはないような・・・。 こうなると、どこが悪いのか1つ1つ潰していくしかないですね(痛)

(無題) 削除/引用 No.1634-9 - 2009/11/30 (月) 10:53:39 - DC そうなるとやはりFBSのロット差じゃないでしょうか・・・ マウスのBM-DCは経験豊富との事ですので、DCの性質や取り扱いには習熟されていると思いますし。 この際、ヒトであれば最適化した無血清培地も売られていますし、そっちに乗り換えてしまうのも手かもしれませんね。 後は、培地へ添加している試薬のエンドトキシンレベルとか。 MACSで単離したMonocyteをGM-CSF単独で培養してマクロファージが分化しているかとか、そういった実験でMACS後の細胞の活きはある程度わかると思います。 わたしも学部4年の時にMACS使ってMoDCの誘導していましたが、そんな未熟な学生でも誘導できていたのでMACSの操作でMonocyteが痛みすぎるとかはありえそうにないと思いますが・・・

(無題) 削除/引用 No.1634-8 - 2009/11/30 (月) 00:24:33 - ゆき >う様 ご意見、ありがとうございます。 マニュアルMACSでポジティブセレクションを行っているので、細胞が弱っている可能性があるかもしれません。 論文ではCD14+細胞でセレクションしたのちに培養しているのが多かったのですが、セレクションしないで接着させてからの培養も行ってみたいと思います。 >FACS様 ご意見、ありがとうございます。 実はマウスの骨髄からDCの誘導はもう何年も行っていて問題なくDCの分化はするのですが、humanは経験がなくて・・・ 参考文献、ほんとにありがとうございます!! >kanata様 ご意見ありがとうございます。 サイトカインは2社ほど試してみましたが、やはり細胞が接着しないので、シャーレを検討しようかと思っています。 ただ、マウスのDCやその他の細胞株、PBMCを播種したのち接着する細胞は他の研究員が確認しているので、MACSで分離した細胞が死んではいない(MACSでの分離後の生存率はほぼ100%でした)が弱っているのでしょうか・・・。 浮いた細胞をFACSとのご意見でしたが、ほとんどの細胞が浮いて死んでしまっているので、最初の接着段階に問題があるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1634-7 - 2009/11/29 (日) 08:33:02 - Kanata ドナーをかえるのは最後の最後です。 他に検討するべき点がたくさんありますよ。 細胞数は大体そのぐらいが適しているようなので(論文各種、自分の経験より)サイトカインやシャーレを検討されるのはいかがでしょうか。 PBMCをシャーレにまくと、モノサイトはかなり強力に付着します。多少乱暴にウォッシュしても剥がれないぐらいです。それが付着しないとすると、細胞が弱っているか、コーティングの問題では？と思うのですが。 FACSさんが書かれていますが、DCがmatureになると細胞は浮いてくるはずです。細胞が死んでしまった、と書いていらっしゃいますが、浮いた細胞をFACSで見てモノサイトかDCかを識別することは可能でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1634-6 - 2009/11/29 (日) 07:55:24 - FACS うさんのおっしゃられてるPBMCからのadherent cellを用いる方法で MACSの操作によるダメージを回避できます。 http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/General_Information/x65969-isct_web_poster.Par.0001.File.tmp/x65969-isct_web_poster.pdf また、上記に写真も出ていますが、matureになってるほど形がDCらしくなり、浮遊するはずです。

(無題) 削除/引用 No.1634-5 - 2009/11/27 (金) 12:21:08 - う 可能性として MACSが下手で細胞が弱っている 培養が下手 サイトカインが悪くなっている 血清が合っていない シャーレが合っていない 実際見ないとアドバイスはこれくらいしかできない。 １つ、あるとすれば PBMCを単離して、単にシャーレにまいて２時間もすれば単球はくっつく （見た目ではほとんどわからないわからないかもしれないが） そしてそのときに浮遊している細胞を培地を交換することで除き サイトカイン入りの培地を加えると５～８日後にはマクロファージには分化されることが可能である。 これでほとんど９０％以上はマクロファージであり、この方法で実験に使うことも可能。 加えるサイトカインを帰る事でDCに出来るかどうかわからないが、試してみるのもいいかもしれない。 それよりも、ちゃんと論文とかでいろいろ分化の方法はあるのだから、調べて試すくらいのことが必要だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1634-4 - 2009/11/27 (金) 11:09:34 - ゆき >Kanata様 ご意見、ありがとうございます。 細胞の密度ですが、論文を参考に12well plateのときは5x10^5cells/mlです。10cm dishのときは1x10^6cells/mlでした。 培地交換は3日目に培地半分を新しい培地+サイトカインを添加しています。細胞はほとんど浮遊して、0日目のようにしっかりと丸い形ではなくなってしまいます。 PBMCは研究室のMDの方から同僚のを採取してすぐにMACSにて単球を分離しています。 やはり、いつくかのドナーで試してみるしかないですか・・・ >FACS様 ご意見、ありがとうございます。 MACSにて分離後、死細胞をトリパンブルーで染めていますが、このときはほぼ100%生きていました。 培養6～7日目にはほとんど細胞が死んでいる、というよりは細胞の形として残っていないのです。 MACSの会社に問い合わせたところ、FBSに原因があるとかないとか・・・ ネガティブセレクション、予算があれば考えてみます(笑) 培養3日目には細胞が付着していないとなると、使用しているplate、dishに問題が？ PIやDead/Cell Dyeは使用したことないのでわかりません、すみません・・・。

(無題) 削除/引用 No.1634-3 - 2009/11/27 (金) 06:31:34 - FACS 2日毎に半分ずつmediumを交換するべきですが、交換しなくても10日のmatureDCまで何とかいけています。 CD14MACSのpositiveselectionだと細胞にダメージが多いのでnegativeselectionkitかadherentcellを考慮してみてもいいかもしれませんね。 ただし、ある程度の細胞死はどの方法でもおきます。 FACSの解析上はFSC/SSC上で30-40％くらいがDCゲートです。 逆に質問ですが、DCでPIやDead/Cell Dyeを染めるとめちゃ染まってしまうんですが、DCは食細胞なのでそういうものなんでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1634-2 - 2009/11/27 (金) 03:37:05 - Kanata 細胞密度はどれくらいですか？低すぎるとうまくいかなかったことがあります。極端に高すぎても難しいですが。 培地交換などどうされましたか？また、細胞の形が崩れるというのは、付着した状態でしょうか、浮遊してしまっていますか。 私は病院からもらったPBMCをDCではなくMFに分化させていましたが、研究室の同僚から採取したPBMCから取るのと比べて、うまくシャーレに付着しない傾向にありました。（時間がたっていた？？）そこでシャーレをpoly-l-lysineなどでコーティングしたところ、接着率が若干向上しました。 ただ、他の研究者の方には特別なことをしなくても接着して分化すると言われたので、ドナーによる可能性もいまだ捨てきれていませんが。

PBMCからDCへ分化誘導 削除/引用 No.1634-1 - 2009/11/26 (木) 21:39:12 - ゆき はじめまして。 現在、ヒトPBMCからMACSにてCD14+細胞(単球)を分離し、human GM-CSFおよびIL-4を添加した培地で培養し、MDDCへと分化させています。 しかし、培養6～7日には細胞がほとんど死んでしまいます(培養0日での細胞数が1/10まで減り、細胞の形が崩れる)。単球の分離後はFACSにてCD14+cellが90%以上であることを確認していますが。 GM-CSFは500IU/ml、IL-4は100IU/ml(いずれもPEPROTECH)で培地にはRPMI-1640(SIGMA)、10%FBS、L-glutamin、2-Me、ペニシリン、ストレプトマイシンを使用しています。 培養には10cm dishや12well plate(いずれもグライナー製)など使用してみましたが、結果は同じでした。また、CD14+cellはdishやplateにほとんど接着しませんでした。単球なら接着すると思うのですが・・・。 もしこのようなPBMCからMDDCへの分化の実験を行ったことがある方、条件が悪い、このようにしたら良いといったご意見、ご感想をお願いします。

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