全22件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

(無題) 削除/引用 No.1633-24 - 2009/11/30 (月) 21:40:34 - nanasi ・RIPAはすべてのタンパクを可溶かし、機能的なタンパク質を破壊する可能性がある ・TNEバッファー（NP-40 lysis buffer)は生理活性を保持した状態で回収することに適している。核など可溶化しずらいタンパクもある。 （タンパク実験ノート,羊土社） と、使い分けはありますが冷凍でアクチンが検出できなくなるとは不可解な話です。 ラボの先輩など、他のメンバーはどうでしょうか。 もしかしたら-80℃での急冷がダメージを与えているのかな…と思っているのですが、-20℃（-30℃）でも同様の現象が起こるのでしょうか。

お世話になっております。 削除/引用 No.1633-23 - 2009/11/30 (月) 19:50:55 - トピ主 やはり、濃度を減らして流しても見えるようにはなりませんでした。 正直、ここまで色々して失敗だと原因がよくわかりません。 試薬もだいぶなくなってきたので、 この機に新しく買いなおして、一からやりなおしてみることにします。 使用する試薬は、PIRCEのRIPA(89900), SigmaのPIC(P8340) 方法は、上記ＲＩＰＡの使用書どおりにやり直してみようとおもいます。 本日注文いたしましたので、結果がでるには少しかかりますが もし、この問題とまだ付き合ってくださるかたがいらっしゃいましたら また更新いたしますので、ご指導よろしくおねがいいたします。 【参考までに使用書の回収方法↓】 Procedure for Lysis of Monolayer-cultured Mammalian Cells 1. Carefully remove (decant) culture medium from adherent cells. 2. Wash cells twice with cold PBS. 3. Add cold RIPA Buffer to the cells. Use 1 ml of buffer per 75 cm2 flask containing 5 × 106 HeLa or A431 cells. Keep on ice for 5 minutes, swirling the plate occasionally for uniform spreading. 4. Gather the lysate to one side using a cell scraper, collect the lysate and transfer to a microcentrifuge tube. Centrifuge samples at ~14,000 × g for 15 minutes to pellet the cell debris. Note: To increase yields, sonicate the pellet for 30 seconds with 50% pulse. 5. Transfer supernatant to a new tube for further analysis.

(無題) 削除/引用 No.1633-22 - 2009/11/29 (日) 22:53:26 - c カルパインというプロテアーゼがあるのですが、これはactinをよく分解する酵素として知られています。この酵素は骨格筋などでよく研究されています。カルパインインヒビターは市販されていますのでもしも心当たりあれば、入れてみるとよいかもしれません。あとsolanainという植物由来のプロテアーゼは耐熱性でSDS存在下でも強い活性を示します。似たような種類のproteaseをもつかどうかも調べてみてください。

(無題) 削除/引用 No.1633-21 - 2009/11/29 (日) 13:12:22 - c PCというのはpre coldという意味かなとおもいましたので、とりあえず仮にそう想定してお話しします。まず蛋白質濃度を定量されていないことと、ゲルサイズ（ミニゲル、or ラージゲル？）か不明なので、アプライ量が果たして適切かどうかはちょっとわかりません。これらの点はオーバーローディングの問題を考える時には非常に重要な情報なので、次回は定量した方がいいです。私は通常はミニゲルで5~10μg/laneくらいで行っています（アクチンなら5μg以下でいいのではないかと思います）。オーバーローディングによって検出出来なくなることはあります。その場合はバックよりもバンドの部分が薄いあるいは白抜けのように見えることがあります。ただオーバーロディングで検出できないという問題が生じるのは、かなりたくさんアプライしたときで、適切な量のx2~3くらいの範囲ならちょっと考えにくいです。ただ少量でむしろ見えているということなので、その可能性は否定出来ないので４点くらい濃度を振って検討してみる意味はあるかもしれません。 あと、アプライ量を変えてきちんと検出出来たPCのほうはどのくらいアプライしたのでしょうか。凍結後のサンプルと同じ量でしょうか。もしそうならば、原因はオーバーローディングではないと思われます。その他の点として、凍結サンプルは完全に溶解させていますか。室温に戻して溶かして軽くボルテクスして下さい。あと細胞は何という細胞ですか。アクチンになにか特徴的な変化、プロテアーゼによる分解などが起きやすいという論文はありますか。他の種類の細胞をお持ちでしょうか。もしもあれば他の細胞でも同じことが起きるのかどうか見てみる必要があるでしょう。 もしも単にローディングコントロールでアクチンをみたいということならば、この問題は本質的ではないと思うので（あまり労力を割くところではないと思うので）アクチン以外のものを使うということで先に進むのはダメでしょうか。わたしは通常はチューブリンとかをつかってます。

(無題) 削除/引用 No.1633-20 - 2009/11/29 (日) 12:56:18 - 通りすがり 目的のバンドの蛋白量が多く、ＥＣＬ発色試薬が少ない場合、反応が一瞬で終わってしまいバンドが薄くなってしまうという話を聞いたことがあります。 羊土社の「検出と定量のコツ」だったかな・・・。ちょっと不確かで申し訳ない。 細かいことですが私はトリプシンではがす方法を好んでいます。これで差が出るとは考えにくいですが。 培地を50mlチューブに除去→トリプシン→先ほどの培地と冷PBSでピペッティングしながら細胞を50mlチューブに回収→４℃1000回転,10分→培地除去,1cc 冷PBSを加えて1.5mlチューブへ→４℃4000回転1分→ＰＢＳ除去→可溶化 再プローブする予定がないならメンブレンもＣＢＢ染色して濃さを確認してみては。 細かいことですが5μlと15μlを同一のゲルで流そうとするとバンドが乱れる場合があります。 ・sample 5μl＋1×SDSサンプルバッファー=15μl ・sample 15μl　　　として流したほうが美しい泳動を得られるように感じます。マーカーも同様。

lysateは濃すぎると、見えるバンドも見えなくなるの？ 削除/引用 No.1633-18 - 2009/11/29 (日) 11:35:49 - トピ主 お世話になっております cさんより教わった方法で、アクチンを検出してみました（下記参照）。 しかし、目的のバンドはかなり薄い状態でした。しかも、5ulと15ulアプライ して検出できていたのは5ulのほうでした。もちろんPCはキレイに検出されていました。 ＣＢＢでゲルを染めると、ちゃんとアプライ量に依存した染色が確認されました。（ＰＣのlysateは5ulアプライ時よりも、まだ少し薄い感じでした。lysateの染色パターンについてはＰＣもサンプルも同じようにみうけられました。） →これは、アプライ量が多すぎると抜け見えたりするのでしょうか？ →5ulよりさらに薄めて流すべきでしょうか。 →そもそも、なにか下記プロトコルでなにかおかしいところはありますでしょうか？ ご連絡いただけましたら幸いです。よろしくお願いします。 ■1-2x10^6くらいの細胞株(55cm2, 10cm dishにサブコンフルエント) ↓Wach (ice-cold PBS x 2) ↓Add 0.5ml SDS-sample buffer　 　（0.0625M Tris-HCl(pH6.8)、2%SDS, 10% glycerol+Inhibitor cocktail 20ul, sigma) ↓氷上にて5分、たまにプレートを傾け全体にいきわたるようする。 ↓スクレーパーにて1.5mlチューブに回収 　→大体0.7-0.8mlになる。かなり粘性あり ↓bathtype sonicator (5min,氷水をしよう,　粘性がなくなる) ↓10,000gで遠心して不溶物除去(ほんの少しペレット有)、上澄を回収 ↓(BCA法で蛋白質定量←今回はやっていません。） ↓BPB(1%BPBをfinal.0.004%くらいに)と 　bME(fina5%くらいに）を加える。 ↓加熱処理（Boil, 5min） ↓-80C保存 ↓サンプル5ulと15ulをapply（以前回収したＰＣとともに）。 ↓通常の検出にて以下検出　（ゲルはＣＢＢ染色。）

ありがとうございます。 削除/引用 No.1633-17 - 2009/11/28 (土) 00:24:03 - トピヌシ ｃさん、低分子さんお返事ありがとうございます。 まず、ｃさんのプロトコルをためさせていただこうかとおもいます。 土日をはさみますので、実験できるかわかりませんが、結果わかり次第 ご連絡させていただきます。 取り急ぎ、お礼申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.1633-16 - 2009/11/27 (金) 21:38:59 - c さっき書いたSDS-sample bufferとは通常のSDS-PAGEのサンプルバッファーのことです。私の使っている(1x濃度)SDS−sample buffer　(beME,BPB抜き）の組成は0.0625M Tris-HCl(pH6.8)、2%SDS, 10% glycerolです。多少の濃度の違いはあるかもしれませんが、とりあえず普通によくあるsample bufferでOKです。これで細胞を溶かして、先に書いたような手順でサンプルを調製しています。bMEとBPBをまだ入れないのは、BCA protein assayに支障が出るからで、蛋白質定量が済んでから(SDSの許容範囲は説明書で確認して下さい）、最終濃度でbME 5%, BPB は適当な量を直接サンプルに添加してます。それから10分くらい97Cで加熱してさましてから電気泳動にかけてます。すぐにやらないときは小分けして-80Cで保存してます。2~3ヶ月前のものをWestern blotしたりしてますが、すくなくともこれまで私の調べた蛋白質については問題は起きてません。先ほども書きましたが同じサンプルを何度も凍結融解くりかえしてると蛋白質の泳動パタンがだんだんスメアっぽくというかバンドがぼーっとなってきたことがあります。とくに-20C保存のとかだとけっこうきます。分解かなともおもいますが、bMEを新たに加えたら、バンドのボーッとしたのは無くなりましたのでbMEが長い間に酸化されてダメになってシステインのSHがゆっくり再酸化されてs-sとかが変なふうにランダムに再生したとかもあると思います。そう考えると分解だけでなくs-sを介した高分子量化とかもあるかもしれません。 あと念のため、抗体とかブロッティング装置とか検出系とかも一応チェックした方がいいですね。

(無題) 削除/引用 No.1633-15 - 2009/11/27 (金) 17:50:55 - 低分子 一応私はこれです（膜タンパク時）。質問者さんとの違いは可溶化時のSDSの有無と冷凍するタイミングだと思います。 ○NP-40 Lysis buffer（PBS洗浄後の細胞ペレットを４℃で30-60分可溶化させる.75ディッシュの接着系だったら100-200μl） 20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 137 mmol/L NaCl 10 % Glycerol 1 mmol/L PMSF 0.15 U/mL Aprotonin 10 mmol/L EDTA・2Na 10 μg/mL Leupeptin 100 mmol/L Sodium Fluoride 2 mmol/L Sodium Orthovanadate 1 % NP-40 ↓13000rpm 30分 タンパク濃度測定 ○２×SDSサンプルバッファー (※当量の上清に加える) 125 mM Tris-HCl pH 6.8 10 % (v/v) 2-Mercaptoethanol 4.6 % (w/v) SDS 10 % (v/v) Glycerol 0.004% BPB ↓ 98℃,5分ボイル ↓ 冷凍

cさん、ありがとうございます。 削除/引用 No.1633-13 - 2009/11/27 (金) 16:38:18 - トピ主 助言いただいたとおり、一度SDS-sample bufferで直接溶かしてしてみようとおもうのですが。 >あとでBPBとbMEを加える ということはSDS-sample bufferとは、Tris, glycerol, SDSからなる bufferということでしょうか。組成を教えていただけますでしょうか。 下記、プロトコルで実験をしようと考えております。 細かい点、変更したほうがよいようでしたらご指摘いただけますでしょうか。 使用する細胞はsubconfluent/100cm2dish 1-2x10^7くらい １）Wach (ice-cold PBS x 2) ２）Add 1ml? SDS-sample buffer (10minくらい?) / on ice ３) スクレーパーにて1.5mlチューブに回収 / on ice ４）bathtype sonicator (5min,　粘性がなくなるくらいに？) ５）遠心して不溶物除去、上澄を回収、 ６）BCA法で蛋白質定量 ７）BPB(1%BPBを10ulくらい？)とbME（final5%くらい？）加えて加熱処理 ８）-80C保存 質問だらけになってしまいましたが、ご連絡いただけましたら幸いです。 よろしくお願いいたします。 少し大きな膜タンパク質も検出しようとかんがえているのですが、使用するSDS-sample bufferでよかったのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1633-12 - 2009/11/27 (金) 13:00:25 - c アクチンが見えなくなったのは、おそらく別の原因と思われます。たしかに保存中に非特異的な蛋白質分解は起こりえますが、アクチン特異的なプロテアーゼとかが活性化しているとかそういった特別な理由がない限り、ちょっと考えにくいです。 もしもRIPA bufferを使うべき特別な理由がないならば、プロテアーゼの影響の点でも可溶化能の点でもSDS-sample bufferで直接溶かす方が変なトラブルは少ないと思います。 私は１）細胞をPBSで２回くらいリンス、２）SDS-sample buffer で可溶化（量に注意して下さい。あまり少なすぎると可溶化が不十分になり、また多すぎると蛋白質濃度が薄すぎてあとで困る）、３）DNAによる粘性がなくなる程度まで軽く超音波、４）遠心して不溶物除去（たぶんほとんどないと思うけど）して上澄を回収、５）BCA法で蛋白質定量、６）BPBとbME加えて加熱処理、-80C保存という感じでやってます。保存中というよりもどうも凍結融解の反復が良くないように思われることが以前あったので、すこし面倒ですが小さいチューブに、使いきりですみたいな感じで何本かに分注して保存してます。あと-20C保存ははあまり勧めません。変な感じに中途半端に下半分だけ凍ってるみたいなときがあるので。厳密にはSDS＆加熱でも蛋白質分解は完全にゼロにはできないし変性によりプロテアーゼの攻撃を受けやすくなるものもあるという考え方もありますが、すくなくとも他の可溶化方法と比べればプロテアーゼの影響かなり抑えられる方法ではないでしょうか。 はじめにTCAを直接細胞に加えてしまう方法も聞いたことがあります。ただ以前にやりましたが、その後の可溶化、とくにもともと溶けにくい蛋白質の場合などではだいじょうぶかなあと気になりました。

(無題) 削除/引用 No.1633-11 - 2009/11/27 (金) 12:10:01 - う ＞今後、もう一からしてみようとおもうのですが。 確認なのですが、 皆さんは、保存・調整に関しては大まかには ↓RIPA溶解液 ↓-80℃、分注？（ＢＣＡ定量後） ↓使うときに溶かしてサンプルバッファーと2MEでボイル ↓アプライ という流れでされて、問題はないということでよかったでしょうか。 っていうか、なぜRIPAでライシスした溶液をそのまんま冷凍保存する必要があるのでしょう？ SDS sample bufferを加えてボイルして冷凍保存すればいいのでは？ 普通そうでしょう？これならほとんど問題ないと思うが。 RIPAでライシスした溶液を凍らると、しばしばタンパク質が不可溶になってしまい 沈殿が生じたり、分解するかもとか変に気をまわさなきゃならんことが多い。 私がこれまで出会った方々で、 RIPAでライシスした溶液を冷凍保存するなんて方はいませんでしたが。

(無題) 削除/引用 No.1633-10 - 2009/11/27 (金) 10:31:31 - 小児科医師（ゆとり教育） >>・・・ちなみに、「一晩保存」なんでしょうか？そうは読み取れなかったのですが。 すみません、読み誤っていました。謝罪して訂正します。

(無題) 削除/引用 No.1633-9 - 2009/11/27 (金) 10:11:52 - Kanata ポジコンが検出できているということなので、WBは問題なさそうですね。 失礼しました。 そうなると、サンプル凍結融解による分解または溶解度の変化ということになりそうですね。 示してくださった保存・調整の流れで問題ないかと思いますが、 私の用いた試料はRIPAでは蛋白を十分に抽出できないことが多いので、CHAPSを用いたLysateバッファーを使っていました。 み　さんの仰るようにフレッシュなものを使うのがベストですが・・・

(無題) 削除/引用 No.1633-8 - 2009/11/27 (金) 09:37:09 - み 可溶化バッファー状態で凍結保存して融解した場合、ある程度の蛋白は不溶化（変性などによる）してしまいますね。 SDS-sample buffer状態で凍結したとしてもある程度の蛋白分解は起こりますね。おそらく保存期間に比例して・・・。 毎回freshなサンプルを調製するにこしたことはない。

(無題) 削除/引用 No.1633-7 - 2009/11/27 (金) 09:18:55 - z RIPAでは、1%のDOCを使用しているようですが、1% DOCとは約25mMですので、trisの緩衝能に影響する濃度です。更に、DOCは、弱酸性では不溶化します。そこで、最初は溶けていたRIPAですが、凍結融解の過程でDOCが不溶化した可能性はないでしょうか？そうであれば、タンパク質も一緒に不溶化している可能性があります。 可能であれば、緩衝能の有効なpH8｡0のTris-HClを用います。PIPAのDOCは、0.1%（私はこれを使っている）から1%までの多様なレシピがあります。

多数のご返事ありがとうございます。 削除/引用 No.1633-6 - 2009/11/27 (金) 08:44:08 - LYSATEの取り扱い ＷＢの手技は、同時にＰＣとして新しいlysateをながして検出できている ので問題ないかとおもいますが、念のため下記に方法を記します。 ご確認いただけますでしょうか。 invitrogen, 10%PAGE precast gel ↓Loading(40min, 200cV) ↓Blotting(90min, 30cV) ↓Blocking(1h, 1%skim/PBST) ↓1st Ab(1:1000, 1h) ↓2nd Ab(1:2000, 1h) ↓ECL plus 分解サンプルの-80℃での保存期間は約1ヶ月。 使用したRIPA(pierce, #89900)は下記です。 25 mM Tris•HCl pH 7.6 150 mM NaCl 1% NP-40 1% sodium deoxycholate 0.1% SDS 一応ご指摘いただいたNP-40も入っています。 これは、濃度の問題でしょうか。 ―――――――――――――――――――――――― 今後、もう一からしてみようとおもうのですが。 確認なのですが、 皆さんは、保存・調整に関しては大まかには ↓RIPA溶解液 ↓-80℃、分注？（ＢＣＡ定量後） ↓使うときに溶かしてサンプルバッファーと2MEでボイル ↓アプライ という流れでされて、問題はないということでよかったでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1633-5 - 2009/11/27 (金) 03:25:04 - Kanata いくつかひっかかる部分があります。 サンプルの凍結融解を繰り返されましたか？ WBの手法、転写に問題があったかその後なのか、など、確認されていますか。 なんとなくWBの問題かな、とは思うのですが、先に書かれたお二人とは逆に、凍結の問題も否定できません。 どんなにProtease Inhibitorが入っていようとも、-80℃で保存しようとも、100%分解が起こらない、何年たっても凍結前と同じ結果が得られるという保証は、私や周囲の経験では得られませんでした。ただ、アクチンが全く検出できないほどだとかなり大きな変動があったことになるのですが・・・ 最近参加したワークショップで、プロテアーゼインヒビターを加えても蛋白質の分解は止められるものではない、という情報を得たばかりです。 ・・・ちなみに、「一晩保存」なんでしょうか？そうは読み取れなかったのですが。

(無題) 削除/引用 No.1633-4 - 2009/11/26 (木) 22:36:33 - TS 私もWBの手技に問題があったことに同意です。 冷凍庫に入っている限り、何年後でもアクチンは検出できると思います。 何度か試されたんでしょうか？ 一回やって、うまくいかなかったから、あせって投稿したとか。。。 トランスファーが逆向きだった、抗体入れ忘れ、ECL不活化、などなど、基本的事項は大丈夫なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1633-3 - 2009/11/26 (木) 21:57:14 - 小児科医師（ゆとり教育） RIPA bufferで溶解した細胞抽出液を−８０度で一晩保存するくらいで、ウェスタンブロットで全く検出できないくらいアクチンが分解するというのは全く考えられないと思います。私もRIPA bufferの細胞抽出液を-80度で保存して数日〜数ヵ月後にウェスタンブロットで検出する実験をしますが、今までアクチンが分解するという状況になったことがありません。 ウェスタンブロットの検出のほうに問題があると思います。

全22件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---