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遅くなりました。 削除/引用 No.1627-11 - 2009/12/17 (木) 05:22:07 - へのへのもへじ 結局原因は抗体の析出と考えています。 新しい抗体を買ったら解決しました。

Alexa Flour 488 削除/引用 No.1627-10 - 2009/12/01 (火) 06:40:31 - へのへのもへじ InvitrogenのAlexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgGです。

(無題) 削除/引用 No.1627-9 - 2009/12/01 (火) 05:50:50 - Boston ２次抗体は直接蛍光標識されたものですか？ビオチンラベルのものですか？後者であれば、ストレプトアビジンの結晶化が考えられます。

やってみましたが・・。 削除/引用 No.1627-8 - 2009/12/01 (火) 05:16:24 - へのへのもへじ 厚めの組織で3日間プロトコールでやっているので結果報告が遅くなりました。 結果的にはフィルターを通しても、遠心（3000rpm, 5min)をしても変化はありませんでした。新しい抗体を購入することにします・・。原因としては抗体の析出と思いますが、そうでしょうか？

了解 削除/引用 No.1627-7 - 2009/11/26 (木) 10:36:36 - へのへのもへじ フィルターを試してみます。

フィルター 削除/引用 No.1627-6 - 2009/11/26 (木) 09:38:42 - ぽすどく 　自家蛍光ではないとのことですが、私もBostonさんに賛成でブロッキング液をフィルトレーションすることをまずは試します。 　勘ですが、抗体そのものではなくて、それを希釈しているブロッキング液（血清）側が怪しい様な気がします。

(無題) 削除/引用 No.1627-5 - 2009/11/26 (木) 08:36:51 - CJ 蛍光抗体は経年変化で凝集することが知られていますから、それなんじゃないかと私は思いました。しっかり遠心して上清を使う、というのが一般的ですが、フィルターを使う、という方法があるとは知りませんでした…。参考になります。

(無題) 削除/引用 No.1627-4 - 2009/11/26 (木) 07:51:22 - へのへのもへじ 自家蛍光という言葉をしりませんでした・・。 他のチャンネルでは同じような蛍光は認めませんでした。

(無題) 削除/引用 No.1627-3 - 2009/11/26 (木) 07:22:41 - Boston 同様の経験があります。非常に強い蛍光のスポットですよね。他のチャンネルで蛍光が認められなかったので、自家蛍光ではないと思います。ブロッキング溶液をフィルター（０．４５micor）に通したら改善されました。

自家蛍光？ 削除/引用 No.1627-2 - 2009/11/26 (木) 06:46:42 - ぽすどく 　まず、本当に2次抗体の蛍光によるものか念のためもう一度確認する必要があるかと思います。 　その蛍光と違う色のチャンネルで観察して見てください。それによって、自家蛍光かどうかわかるはずです。もし自家蛍光の場合、一つの可能性としは、血清などにバクテリアが繁殖している可能性があります。 　他にもいろいろと可能性はあると思いますが、まずは自家蛍光かどうかを確認していただき、その結果をご報告いただけば、今後のトラブルシューティングの的が絞れてくるように思います。

蛍光2次抗体の結晶化？ 削除/引用 No.1627-1 - 2009/11/26 (木) 06:13:12 - へのへのもへじ 2重染色で蛍光抗体を使用しています。 染色後に顕微鏡で標本を確認したところ非特異的に結晶化した蛍光物が散見されます。同じ原液でも以前は認めていませんでした。 抗体の保存は分注後‐20℃ 原液をスライドガラスに塗布してみてもほとんど結晶は見当たりません。 軽く（3秒位）遠心して上清だけ使用しても結晶は認めます。 結晶を認めない2次抗体とは別々に準備して切片にapplyしています。 どのようなことでこうなっているのでしょうか？ この抗体はもう駄目なのでしょうか？

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