pMD20T-vectorを使って形質転換後、シーケンスしています。
転換後は、ミニプレップでベクターだけにしています。
プライマーはM１３を使っています。シーケンサーは、Applied Biosystems 3130xlジェネテリックアナライザーです。
以下にプロとコールを書きます。
template 20ngから100ng（ベクターの濃度）
Bigdye1.1 1μL
primer 0.5μL(3.2pmol/μLで保存)
Buffer 3.5μL
滅菌水 適量
トータル２０μLに調整
96℃ 1min 1×1cycle (96℃10sec 50℃×5sec 60℃×4min)×25cycle 4℃hold
以下室温
PCR産物 20μL
滅菌水 20μL
イソプロパノール 60μL
↓12,000rpm 20min
上澄み捨てる
80% EOH 150μL
↓12,000rpm 3min
上澄みを捨てて、HiDi 20μLに溶解
↓96℃ 3min
on ice
です。300から600bpをシーケンスしたのですが、ピークがほとんどなく、読める配列も200bp程度です。Bigdyeを２倍に増やしたりtemplateを増やしたり工夫しているんですが、全く効果がありません。エタ沈後の吸い出しも吸引機を利用しています。原因がさっぱりな状態です。助けてください。
ミニプレップからし直した方がいいんでしょうか？吸引時に吸引しすぎているんでしょうか？PCRのTm値が低いのでしょうか？
ご協力、お願いします。 |
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