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(無題) 削除/引用 No.1625-22 - 2009/12/01 (火) 13:49:02 - AP >EtOH/EDTA/AcONa pptになっていますが、同じメーカーのパンフ（条件検討やtipsなどを載せた刊行物）で、ver 1.1ではProOHのみの沈殿がフリーを除くのに効果的だということが出ていました。 現物をなくしてしまったので、裏をとるためにweb上にないか探してみました。 見つけはしましたが、もうふつうにリンクをたどって見つかるものではなく、古文書ですね(377が最新機種、Dye-terminatorが現役で、BigDyeの最初の製品がでたばかりのころ）。メーカーとしてはもう廃止した方法ではないでしょうか。 ttp://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_support/documents/generaldocuments/cms_040995.pdf

(無題) 削除/引用 No.1625-21 - 2009/11/30 (月) 21:30:09 - あかね ミニプレップの精製が不十分で最終サンプルに多量のRNAが含まれていることは無いですか？ つまり200 ngと信じている濃度も実はRNAの除去が不十分で本当の濃度ではないと？ PEG沈してみたら？

(無題) 削除/引用 No.1625-20 - 2009/11/30 (月) 21:23:47 - きつね Bostonさん ありがとうございます。少しPCR反応時間を延ばしてみます。 ポジコンが、同じ条件でしっかり出たのでアニーリング温度を考えていませんでした。 〜さん ありがとうございます。精製方法は ミニプレップ（アルカリSDS法→RNase処理）→イソプロパノール のみです。やはり、エタ沈などをするべきでしょうか？ おおさん ありがとうございます。BIGDYEを少し増やしてみようと思います。 ただ、BIGDYEが高くて勇気が... APさん、ばいやさん ありがとうござます。やはりサンンプルも疑うべきですか？ もともと１２塩基ほどのRAPD PRIMERでPCRし、TAKARAのMIGHTY KITでライゲーションしました。ライゲーションした配列にM13プライマーの配列が含まれていると記載されていたのでシーケンスにもインサートチェックにもM１３を使用しました。 あと、もう一度マニュアルを読んでみます。 PDIさん ありがとうございます。やはりBIGDYEですか...少し教授と相談してみます。

(無題) 削除/引用 No.1625-19 - 2009/11/30 (月) 15:50:23 - ばいや >[Re:12] きつねさんは書きました : > お恥ずかしながら、元の条件を知らないんです。他の研究室がしたプロトコールでしているので…。その時はできたらしいです。EDTAも確認しましたが。不要とのことでした。プラシミッドは、インザートチェックをして目的のものであることM13 primer(ライゲーション、シーケンスで利用)で使えることは確認しました。 > すみませんが、立体構造のことを詳しく教えていただけませんか？ http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1534 M13プライマーで、「ライゲーション、シークエンスで利用」の意味が分かりません。APさんが聞いていた・・・。

(無題) 削除/引用 No.1625-18 - 2009/11/30 (月) 11:47:00 - PDI Bigdyeの量を増やすと読める可能性があります。 当方でも一時期、ＰＣＲ産物のシーケンスは読めるのに、プラスミドは読めないことがありました。解決法はBigdyeを３マイクロＬ以上加えることでした。

(無題) 削除/引用 No.1625-17 - 2009/11/30 (月) 11:42:40 - AP >お恥ずかしながら、元の条件を知らないんです。他の研究室がしたプロトコールでしているので…。その時はできたらしいです。 どっちにしろ、標準マニュアルは目を通しておくべきです。メーカーサイトからDLできますし、研究室のどこかにはあるのでは。 各研究室でモディファイしたプロトコールに従うというのはいいですが、正式な方法を知った上でするべきです。そうじゃないと、今みたいに問題が起こったときにろくにトラブルシューティングもできないでしょう。 例えば、プレミックスが標準よりずいぶん少ないですが、それは十分なシグナル強度が得られるときには、そうしてもかまわないですよ程度のにしかマニュアルでは扱っていません。

(無題) 削除/引用 No.1625-16 - 2009/11/30 (月) 11:32:50 - AP >クローニングに使用したM13primerでしているんですがダメなんです。 これはM13 primerでPCRしたインサートをベクターにクローニングしたということでしょうか。そうだとしたら、ベクターにはM13 primerのアニールサイトがもともとあるので、インサートの末端とベクターの両方からプライミングしてしまいますね。ずれた波が重なって、わけわからないことになりますが。そのベクター、シークエンスにはSP6プライマーなんか使えたはずではなかったかな（SP6プロモータ配列はベクター、メーカーによって少々バリエーションがあるので、プライマーの配列がそれにあっているか確認しましょう）。 ver1.1もver3.1もメーカーの標準マニュアルではEtOH/EDTA pptかEtOH/EDTA/AcONa pptになっていますが、同じメーカーのパンフ（条件検討やtipsなどを載せた刊行物）で、ver 1.1ではProOHのみの沈殿がフリーを除くのに効果的だということが出ていました（それからずいぶん年月がたっているけれど、標準マニュアルに掲載されていないのが気になりますが）。ver 1.1を使うとき、私はそれを採用していましたが、結果が悪くなるということはなかったですよ。今はほとんどカラムかX-terminatorで精製しますけれど。

(無題) 削除/引用 No.1625-15 - 2009/11/30 (月) 11:20:30 - おお Bigdye1.1　 1uLと言う事は今思い出せないのですが、従来の1/8の量ですか。。。それとも1/4かな、、、かかりにくい時は増やした方がいいかもよ。 3ulぐらい使ってみたら?

(無題) 削除/引用 No.1625-14 - 2009/11/30 (月) 09:47:25 - ~ Ver.3しか使ったことがないのですが、プラスミド精製はどうされていますか？ ポジコンは読めていると言うことですし、 単なるアルカリSDS法→イソプロ沈まででは精製度が足りないのかもしれません。 私は アルカリSDS法→RNase処理→PEG沈→PCI,CIA抽出→エタ沈 カラム精製 のどちらかでシークエンシング用サンプルを精製しています。

(無題) 削除/引用 No.1625-13 - 2009/11/30 (月) 09:12:10 - Boston インサート確認時の PCR の条件はどんなものでしょうか？アニーリングは５０°Cでしょうか？５秒はちょっと短いのかもしれません。その前の変性も１５秒と気長に設定しても良いかもしれません。

すみません！ 削除/引用 No.1625-12 - 2009/11/30 (月) 00:01:48 - きつね 言い訳にしかなりませんが、トピに投稿があれば、メールで通知するシステムにしてたんですが、届かなくて…。みなさん、ありがとうございます。 あかねさん。 ご意見ありがとうございます。BigDyev1.1の場合、塩の添加は不要とのことです。 Bostonさん。 クローニングに使用したM13primerでしているんですがダメなんです。 in situ さん。 別の研究室で一度されてたんですが、問題はなかったそうです。 iiさん。 機械の不具合ですか？つまり、キャピラリーが折れていたり詰まっているってことですか？ 千夏さん。 勉強不足ですみません。シールして転倒4回というのは、手ですればいいんですよね？ あと、精製が足りないということでしょうか？それともDNAが絡まっているから読めないということでしょうか？ ばいやさん。 お恥ずかしながら、元の条件を知らないんです。他の研究室がしたプロトコールでしているので…。その時はできたらしいです。EDTAも確認しましたが。不要とのことでした。プラシミッドは、インザートチェックをして目的のものであることM13 primer(ライゲーション、シーケンスで利用)で使えることは確認しました。 すみませんが、立体構造のことを詳しく教えていただけませんか？ おぉさん おっしゃる通りポジコンがあったのでしてみました。 すると、先述した通りのプロトコールでシグナルが出て600bpくらい読めました。 しかし、templateを変えると出ませんでした。そこで、現在、ミニプレップをし直しています。 破裏拳さん。 すみません、返信を頂いていたのに…。 ポリマーを交換してもらいキャピラリーが詰まっていないことも確認しました。多分、機械の問題ではないのでは、とのことです。 追加で質問なのですが、形質転換にはpMD20-T vectorを使い、それに使えるprimer(M13)でインサートチェックもしました。 しかし、同じprimerを使ってもシーケンスはできませんでした。こんなことってあるんでしょうか ？ミニプレップや何らかの原因でM13 primerが働くところが、変になってしまったのでしょうか？ よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.1625-11 - 2009/11/26 (木) 15:04:37 - 破裏拳 ・ポリマー交換 ・キャピラリ交換 急いでる割に、トピ主さんからのレスがつかないのねｗ

(無題) 削除/引用 No.1625-10 - 2009/11/26 (木) 09:19:28 - おお 反応ようきっとにポジコンがついてなかったっけ。 それもよめないのかなぁ?

(無題) 削除/引用 No.1625-9 - 2009/11/26 (木) 09:13:13 - ばいや とりあえず、基本に戻る。 テンプレートは200-300ng、BigDyeは8uL、primerは3.2pmol/sample、bufferなし。元の条件はこうじゃなかったですか？ イソプロのときはEDTAを入れるのでは？（うろ覚えです） あと、このサンプルだけ読めないのか、きつねさんだけ読めないのか、どうなのでしょう。 ちょっと前のトピにもあったように立体構造の影響かもしれないです。（あれは結局解決したのでしょうか？あきらめたのでしょうか？解決したならどのようにして解決したのか知りたいですね。外注だったけど）　PCRはちゃんとかかりますよね？プラスミドの確認は大丈夫ですか？プラスミドの確認がダメなら取り直したほうがよいように思います。

(無題) 削除/引用 No.1625-7 - 2009/11/26 (木) 08:54:19 - 千夏 以下室温以降のプロトコルを変更。 反応済みサンプル　20 ul 125mM EDTA 2 ul 3M 酢酸ナトリウム 2 ul 100% EtOH 50 ul シールして転倒4回 15分室温放置 遠心　2 k x g, 45min, RT 裏返してふってsupを捨てたのち、70% EtOH 70 ul 遠心 2 k x g, 15 min, RT ピペットでsupをきれいに取り除く 15分室温放置 20 ul HiDi添加 10分室温放置 95℃, 2 min on ice apply

(無題) 削除/引用 No.1625-6 - 2009/11/26 (木) 08:12:11 - ii 機械の不具合

(無題) 削除/引用 No.1625-5 - 2009/11/26 (木) 00:12:15 - in situ 研究室のほかの方も読めていないのでしょうか？ 自分のところでも、一時期、ピークが全くでなくなる、もしくは出づらくなるトラブルがあったことがあり、原因追求に追われていたことがあります。 原因は １．Big Dyeのロットによる不具合 ２．thermal cyclerの不具合 だったと記憶しています。 BIORADの最近の型だと、ふたを強く締めすぎるとふたが浮いて温度制御がうまくいかなくなったりします。 今までにうまくいっていた方法でうまくいかなくなったのであれば、方法自体を疑うより、最近ロットなり機械なり変えた部分を一つずつチェックしていくのが確実かと。 あと、当然ですが、今まで読めたことのあるものはポジコンにおきましょう。

(無題) 削除/引用 No.1625-4 - 2009/11/25 (水) 23:26:21 - Boston インサート（目的遺伝子）をクローニングした際に使用した Fwd／Rev primers をシーケンスに使われてみては如何でしょうか。 あとは吸引時に吸ってしまったのか（面倒ですがピペットマンで吸うとか）、最後の溶解が不十分なのか（ヒートブロックを５分に延ばす）？

(無題) 削除/引用 No.1625-3 - 2009/11/25 (水) 23:20:49 - み プロパノール沈の時に塩は添加しておかなくていいの？

(無題) 削除/引用 No.1625-2 - 2009/11/25 (水) 23:16:46 - あかね templateのDNAが多すぎるから最初の200bpくらいしか読めないのでは？

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