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ありがとうございます 削除/引用 No.1620-8 - 2009/12/05 (土) 03:51:10 - KR みなさま、貴重なお時間をありがとうございました。スクロース置換の時間は、そんなに影響がないということですね。とても参考になりました。

(無題) 削除/引用 No.1620-7 - 2009/12/03 (木) 11:52:40 - Boston 私が所属するラボでは、4%PFA 氷上１５分固定後、スクロース置換（室温、２hr）、ゼラチン／スクロース置換（３７°C、１hr）、ゼラチン／スクロース包埋（イソペンタン／液体窒素）、−８０°C保存 固定で失活しやすいGFP の蛍光を失う事なく、長期保存できます。

(無題) 削除/引用 No.1620-6 - 2009/12/03 (木) 11:26:22 - SY はじめまして。 免疫染色を日常的に行っているものです。 我々はサンプルを採るときの都合で、一度に大量にサンプルが集まります。 そのため、置換後1日や2日でスライスすることが不可能です。 そのような状態ですので、スクロースに浸ったままサンプルを保存していますが、時間がたっても染色に影響が出たことはありません。 どちらかというと、切片にしてしまってから時間がたったものの方が染まりは良くないように感じます。ホールで保存しておいたほうが経験的には断然いいです。２，３ラボを移り染色を立ち上げましたが今までそれで問題はありませんので。。 染色が上手くいかないのは、多くは（ほとんどが）染色自体のプロトコールによるものだと思います。

(無題) 削除/引用 No.1620-5 - 2009/11/26 (木) 18:04:25 - tani CJさん、ありがとうございます。固定によって失活する物質にはこの方法では無理ということですね、納得！！

(無題) 削除/引用 No.1620-4 - 2009/11/26 (木) 08:33:51 - CJ おっしゃるとおり、ゆっくりとした凍結では大きな氷の結晶が生じてしまい、それが組織や細胞内構造を破壊します。スクロースやグリセリン溶液で水を置換してやることで、氷の結晶が大きくなるのを防ぐことができます。また、急速凍結も有効な方法です。 液体窒素を使う方法では通常イソペンタンなどの冷媒をかいすることになりますが、イソペンタンの凍結温度より低い温度で冷やすことができないので、それほど温度を下げることはできません。一方、液体窒素に直接漬けるという方法では、標本の周りに気化した窒素が断熱材のように働いてしまい、急速凍結はできません。また、組織にひびが入る可能性があります。 ご指摘の方法では組織表面の凍結は良好であると考えられますが（光顕的には数十ミクロン、電顕的には２−３ミクロンの表面）、奥に入ると氷晶が形成されると思います。スクロース置換を行うことでもっと簡単な凍結法で安定した結果を得ることができます。 なお、スクロース置換の欠点として、標本の固定が必須であることが挙げられます。固定に敏感な組織学技法を使う際には利用できないかもしれません。

スクロース置換って？？ 削除/引用 No.1620-3 - 2009/11/26 (木) 00:57:44 - tani 　過去ログにも氷晶防止のためにスクロース置換のことがありますけれど、やった事がないのでこの場を借りて教えてください。氷晶とはいったいどういうことですか、凍結の際の細胞核にできるあの空胞のことですか？、で、生の材料のときにはそのままスクロースに入れて置換されてから凍結するのですか。肝心なのはいかに迅速に凍結させるか、という目的で、OCTの使用は必要最小限にとどめる、凍結はイソペンタンを液体窒素で冷やしてその中で凍結する、という自分なりの掟を作って行っていますが、いままで問題が生じたことがありません。 ひょっとしたら、自分が行っている凍結標本より、スクロース置換法ってもっとよい凍結標本ができるかもしれないならやってみたいのですが、どうぞ教えてください。

(無題) 削除/引用 No.1620-2 - 2009/11/25 (水) 08:56:32 - CJ 私はスクロースにつけた状態で長いこと（１月以上）おくこともあれば、置換２日後にすぐに切ることもありますが、明確な違いを感じたことはないですね。 もちろん長いこと汁につけておくことで散逸する分子の存在は否定しません。 一方、過固定はしばしば免疫反応性を低下させます。抗体によってはこのあたりは明確に差が出ますね。 ベストな方法は置換後切片作成まで-80℃で保存することです。

免疫染色サンプル作製について 削除/引用 No.1620-1 - 2009/11/25 (水) 06:21:12 - KR いつもお世話になっております。 新しいラボに移り、前のラボで行っていた免疫染色を立ち上げているのですが、前のラボでもサンプルの善し悪しがだいぶあったので、この際、少し改善を試みようと思っております。 そこで、ひとつ質問です。 免疫染色の凍結切片サンプルを作る際に、スクロース置換を行うのが一般的だと思います。スクロース置換は氷晶防止のためであると思うので、十分置換されていれば、問題ないと思っています。スクロース置換の時間を長く浸けると染色性が悪くなると聞いたのですが・・・実際はいかがでしょうか？もし、試したことがある方、あるいは、ご存じの方がいましたら、教えていただけると幸いです。 宜しくお願いいたします。

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