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(無題) 削除/引用 No.1604-11 - 2009/11/24 (火) 23:20:02 - ｙｔ > やはり細胞をPBSでwash後、直接セルスクレーパーで > かき集めて、ペレットにしてお好みの容量のlysis bufferで > とかすというのはこの場合、 もし実験に支障が無ければ、３ｍM程度のEDTA in PBS（もちろんCa,Mgは抜いて）数分置いてから剥がせば用意にはがれるし、細胞の損傷も少ないと思います。細胞にもよると思いますが、十分時間を置けばピペッティングでも容易に剥がれます。 　 それと、もしGPI繋留蛋白とか疎水性がかなり強い蛋白であればTriton X-114抽出を試してみるのも良いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1604-10 - 2009/11/24 (火) 17:41:56 - toyo >あと、一つ疑問なのですが やはり細胞をPBSでwash後、直接セルスクレーパーで かき集めて、ペレットにしてお好みの容量のlysis bufferで とかすというのはこの場合、 細胞が壊れる→プロテアーゼ放出→タンパク分解がすすむ とう流れになりあまりおすすめできないのでしょうか？ PBSに浸漬した状態でスクレープするということでしょうか? 私自身はPBSによる回収を試したことがないですが、あまりお奨めしません。 10% TCAは細胞内のタンパク(プロテアーゼ含む)を変性させるので、TCAに浸漬した 状態でスクレープすれば、タンパクの分解はそれほど進まないのではないかと思います。 参考URLを貼っておきます。 http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/ohmiken/Lab%E3%83%A1%E3%83%A2/memo%208.html それから、膜タンパクは疎水性が高いので(?)、サンプル調整時のボイルは避け、 室温〜低温でしばらく放置(〜O/N)するとよい、という話もあったと思います。 過去ログ等参照してみてください。 参考URLを貼っておきます。 http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/ohmiken/Lab%E3%83%A1%E3%83%A2/memo%209.html 私が以前扱った膜タンパクは、5分ボイルするよりも4℃でO/N放置したほうが 濃いバンドを得られました。

ありがとうございました。 削除/引用 No.1604-9 - 2009/11/24 (火) 14:01:03 - anonyman 返事がおそくなりもうしわけありません。 皆様たくさんの助言いただき有難うございます。 早速、まずＴＣＡ法を試したいとおもいます。 あと、一つ疑問なのですが やはり細胞をPBSでwash後、直接セルスクレーパーで かき集めて、ペレットにしてお好みの容量のlysis bufferで とかすというのはこの場合、 細胞が壊れる→プロテアーゼ放出→タンパク分解がすすむ とう流れになりあまりおすすめできないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1604-8 - 2009/11/23 (月) 00:57:19 - Boston 濃いサンプルと作るという点に関しては、toyp 様と同じプロトコールをお進めします。特に、アセトンは脂質による泳動の乱れをなくしてくれます。ミトコンドリアフラクション --> PBS --> Sonication --> TCAppt --> Cold acetone wash --> Sample buffer --> WB をやって、良い結果を得ました。 それ以外の点ですが、抗体は FACS に使用できる細胞外ドメインを認識するものでしょうか？今までの経験上、この手の抗体は WB では使えませんでした。ただ、2-ME を加えていたので，立体構造が崩れてしまったことが理由かもしれませんが。細胞質内ドメインを認識する抗体は大抵 work しました。

(無題) 削除/引用 No.1604-7 - 2009/11/22 (日) 08:09:02 - おお あ、RIPAで溶解できてないという意見がありますね。 その可能性はあるかもしれませんのでサンプルバファー などで１度溶解してみることは私も一度やった方が いいとおもいます。 わたし一方で夾雑物の多さで感度が落ちている可能性も 若干疑います。だからフラクションをうまくとるという 指摘をさせていただきました。

(無題) 削除/引用 No.1604-6 - 2009/11/22 (日) 08:04:44 - おお ふと思ったのですが200ものせてきれいに流れますか、、 かえって感度を落とすのではと思いますけど、 いがいとそれで検出できないと嘆く人は多いような気がします。 まあ、そういう文献があるからというのは確かにそうですけど、、、、 細胞をPBS-EDTAであらって、同じバッファーでスクレーパーで かきとってけんだくして、遠心(1000g5分くらい)で回収し、 0.2%クラいのNP40低張なバッファー200ulくらいで溶解して みてはどうでしょうか。 基本的に核とサイトゾルを分ける方法ですが、膜は この段階でサイトゾルのフラクションに来ています。 それかピアスとか膜タンパク調せい用のライセートバッファー やサイトゾルと核分離用のライセートバッファーなど うっています。 目的のフラクションをエンリッチして、同等ぐらいの タンパク量をのせるほうがうまく行くことがおおいのでは とおもいます。 期待どおりの回答ではないかもしれませんが、参考までに。

(無題) 削除/引用 No.1604-5 - 2009/11/21 (土) 21:39:18 - c 少なくともアクチンならミニジェルサイズの場合なら1~5μg／レーンもあれば十分検出出来ると思いますし、あくまで一般的な話ですが、特に非常に存在量の少ないものを除けば、たいていの蛋白質は10μg／レーン以内でおそらく検出可能と思います。アプライしている蛋白質量から考えて少なくともアクチンを検出するには十分な量と思います。ゆえにいまの問題は蛋白質量の少なさが原因ではないように思います。他の原因たとえば、蛋白質の濃度とアプライ量の計算、転写、試薬、抗体や抗体反応、検出系等は大丈夫でしょうか。一度、できれば慣れている人にも協力してもらい一連の実験行程や抗体をチェックしてみることを勧めます。 RIPA bufferだとその可溶化が調べたい蛋白質の抽出に十分でない可能性もあるので、実験に差し支えないならば細胞をPBSで2回程度洗った後に、直接細胞をSDS sample buffer（w/o b-ME, BPB)で溶かし超音波処理、遠心により不溶物除去をしたのちに、BCA assayで蛋白質濃度定量の後にbMEとBPBを入れてWesternに持っていったらどうでしょうか。

Re: もっと「濃い」Cell lysateの作り方について 削除/引用 No.1604-4 - 2009/11/21 (土) 19:13:27 - toyo 膜タンパクには詳しくないですが、一般論としてレスさせていただきます。 RIPAではなく10% TCAで回収して沈殿させ、pptをアセトンで洗った後サンプル バッファーに溶かせば、タンパク濃度はいくらでも濃くすることができます。 ただし、1レーンあたりのタンパク量が多すぎると、WBのバンドが薄くなる ことがあるかもしれませんのでご注意ください。

(無題) 削除/引用 No.1604-3 - 2009/11/21 (土) 16:32:08 - ぽこ abc kitで増感してみてください

(無題) 削除/引用 No.1604-2 - 2009/11/21 (土) 15:31:34 - TS なんかいくつか引っかかりますねぇ。 T75に1mLのLysis bufferで溶解しているのであれば、かなりタンパク質濃度の高いLysateができそうですけど。細胞濃度が低いんでしょうか？　 あるいは、RIPA bufferに十分量のDetergentが入ってないとか？ないですか？ それのために必要なタンパク質も遠心後のペレットに行ってしまっているとか。少量のRIPAを使った、いくら少量でもb-actinくらいは、通常検出できると思うんです。 膜タンパク質は、溶けにくいものもたくさんありますし。RIPAの組成は、意外と人によってまちまちなので、開示してはいかがでしょう。 そのあたりが問題ないとすると、対策としては。 1. 細胞濃度を２−３倍にする 2. タンパク質濃度がわからなくも良いなら、いきなり１ｍLの１X sample bufferに細胞を溶解する。 3. もう少し強力なLysis bufferを少量使う。たとえば、0.3% SDS, 10 mM Tris, pH 7.4を私は、好んで使います。溶解した後、ボイル、超音波破砕、タンパク測定、サンプルバッファーに混和、ボイル、SDS-pageです。遠心による不溶性物質の除去は行いません。

もっと「濃い」Cell lysateの作り方について 削除/引用 No.1604-1 - 2009/11/21 (土) 14:56:56 - anonyman はじめまして、 数種類のヒト癌細胞株の膜表面タンパク分子の発現量を、BCAで定量 下のちβアクチン等でベースをひいてＷＢで比較しようとしています。 アクチンは検出できているのですが、目的タンパクの発現量が少なく ほとんど検出することができません。 現在の方法は、 ▼lysateの調整 ↓75cm2フラスコにサブコンフル ↓Wash(ice-cold PBS x2) ↓Add(1mlRIPA, Proteinase inhibitor cocktail) ↓Incbate(10min on ice) ↓Collect the lysate (cell scraper) to 1.5ml tube ↓cfg 15000g, 15min @ 4℃ ↓Transfer the sup to new 1.5ml tube ↓BCA assay(approx.1-2mg/ml) ↓SDS-PAGE（15-30ug/15ul/lane） ↓Blotting ,1st ab and 2nd ab ↓detection by ECL plus 論文によっては、lane辺り200ug以上もアプライしています。 どうしたらこんなにアプライできるのでしょう？ 大きなwellのゲルをつかうしかないのでしょうか。 （フラスコ当たりのＲＩＰＡの量は限界のような気がします。 一度、ペレットにしてみようとEDTA/PBSでペレットにしてから 少量のRIPAで溶かしてみたのですが、結果ぜんぜん細胞が溶けて いなかったみたいでアクチンも検出できませんでした。） いろいろ濃縮法を考えているのですが。膜面分子が標的なので トリプシンもよくなさそうだし、T なにか良い方法をご存知のかたは教えていただけますでしょうか。 よろしくおねがいいたします。

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