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(無題) 削除/引用 No.1591-4 - 2009/11/23 (月) 17:06:14 - ats （→従って、カラムにカップリングさせた抗体が漏れているわけではないようです） ここが間違えている可能性もあります。ウェスタンブロットやELISAで使用する二次抗体は、経験上ウェスタンブロット膜上の変性した（一次）抗体に結合しない（しにくい）ことも多いです。種特異性を出すために各種抗体で吸収しているためではないかと考えています。 抗原を抗マウス抗体カラムに通して素通り画分を用いてみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1591-3 - 2009/11/23 (月) 06:48:36 - Boston いきなり2次抗体にして反応させましたところ、目的の抗原のサイズのところは発色していないのですが（→従って、カラムにカップリングさせた抗体が漏れているわけではないようです） 問題解決にはなっていませんが、カップリングさせた抗体が漏れていても、SDS-PAGE 中（正確にはサンプルバッファー中）で抗原と抗体は乖離すると思います。 イオン交換カラムの精製画分を load するまえに、コントロール画分として elution してみて同じ場所にバンドがでるか確認してみては如何でしょうか？かなり高分子と書かれているので、抗体分子でないような気がしますが。もしこれでバンドがでるようであれば、逆に load するまえの強力な wash と見なせば良いのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1591-2 - 2009/11/21 (土) 02:46:37 - おお 反応する2次抗体をゲルにコンジュゲートして 吸収してしまうというてはどうでしょうか。 金銭的に非効率な方法ですが、、、

ウエスタンで余分な高分子のバンド 削除/引用 No.1591-1 - 2009/11/19 (木) 11:24:07 - ゆう ELISAの抗原として利用したいタンパクを作製しておりまして、昆虫細胞でタンパク発現後、その分泌物をカラム精製しました。 最終段階のアフィニティーカラム（CNBr-activated sepharose）精製の結果、SDS-PAGE（銀染色）により、ほぼ単一のバンドが確認できたのですが、いざELISAの抗原に用いますと、ブランクも発色してしまいました。 そこで、ウエスタンでいつも精製画分を確認しているので、最終精製品に関して、1次抗体（アフィニティーにカップリングさせた抗体）の反応をなしに、つまり、ブロッキング後、いきなり2次抗体にして反応させましたところ、目的の抗原のサイズのところは発色していないのですが（→従って、カラムにカップリングさせた抗体が漏れているわけではないようです）、 かなーーり高分子の位置にバンドがくっきり見えまして、これがELISAのブランクを発色させる原因になっているように考えられます。 このバンドは、最初のイオン交換カラムの精製画分には見えず、マウスで作製した抗体をカップリングさせたアフィニティーカラムの精製画分には、見られます。従って、マウス由来の何かかなーと思ってはいるのですが、うまく分離する方法はないでしょうか？ さらに、ゲルろ過をするのか、ゲル分離？をするのか、できるだけ収率を落としたくないので、効率の良い方法などありましたら、アドバイスいただければと思います。宜しくお願い致します。

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