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(無題) 削除/引用 No.1582-25 - 2009/11/26 (木) 03:43:00 - アクリルアミド 単に新しいのか古いのかどちらかのアクリルアミド粉末が吸湿してしまっていた、なんて事はないのでしょうか？

まじでー 削除/引用 No.1582-24 - 2009/11/25 (水) 22:02:31 - 笑い男 >[Re:23] くまさんは書きました : > アクリルアミドのロットが変わったら分離能が変わっちゃったことがあります。 > 前のストック液のｘ%相当ね　などという会話をしてました・・ 　書き込み頂きましてありがとうございます。おもしろい情報ですね。 にわかに信じがたい状況ではありますが、そんなことも実際に起こり得るんですねー。 　どの程度％がずれたのでしょうか？（覚えておられないかも知れませんが、ストックの濃度とか、ビスの比率とか、１０％を作ったのに分解能的には９％ぐらいだったとか・・・・何か思い出せることありませんか？ 　他にこんな経験をしたことがある、なんて情報を皆様書き込んでいただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1582-23 - 2009/11/25 (水) 09:23:58 - くま 笑い男さんへ 本件とは関係ないかもしれませんが、 アクリルアミドのロットが変わったら分離能が変わっちゃったことがあります。 前のストック液のｘ%相当ね　などという会話をしてました・・ 当時、研究室全体の共有試薬システムで、 何度も検証して、購入試薬そのもののロット違い以外に相違が発見されなかったので、 計算間違いとか入れ間違いとかの可能性は排除されていると思います。

解決して良かったのですが 削除/引用 No.1582-22 - 2009/11/21 (土) 00:48:55 - 笑い男 （もう見ていないかもしれませんが） ％をあげて改善した＆３０％アクリルアミドが原因だったとのことですが、可能であればどのような方法で％を上げたのか（変更後のゲルの組成を書いて欲しい）、３０％ゲルの何がおかしかったのか（ビスの入れ忘れとか、秤量間違いで実際は２０％だったとか）、結果として、どういう泳動結果になったのかを書いて頂けませんか？（同様のトラブルに直面するかもしれない、これからＳＤＳ−ＰＡＧＥを始める研究者の為に） 　というのも、ゲルの％を上げることで低分子は分離できるでしょうが、逆に高分子が十分に分離出来なくなりますよね。　だとすれば、改善したというのは？低分子がある程度分離して、２５０kDaが真ん中まで泳動しなくなったという意味でしょうか？一気にグラジエントゲルまで検討したのですか？泳動時間は変更無しですか？ 　質問の本意は、ピペットさんが何をもって「改善」という判断をしたのか、その判断基準を示してくれませんか？ということです。（裏を返せば、本当の解決には至ってないのとちゃうか？新たな実験で、違うタンパク質を調べたい時に、ちゃんと対応できないのとちゃうかなーという不安が残っていることです。 　お酒が入っているから、少しおせっかい気味にコメントしてみたよーーん

(無題) 削除/引用 No.1582-21 - 2009/11/19 (木) 16:12:29 - ピペット みなさん、ありがとうございました。 ゲルの％を上げたところ、改善できました。 どうやら３０％アクリクアミドがおかしいみたいでした！ おすすめ頂いた書籍やマニュアル見てみます！ ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.1582-20 - 2009/11/19 (木) 09:08:10 - nanashi 7.5%ゲルなら250kDaマーカーも泳動されていきます。 電子テンビンで測定していると思いますが、テンビンのバランス（テンビンの気泡で見る水平）合わせていますか？ いい加減に測定していませんか？ アクリルアミドストック溶液が怪しい気がします。 8.5％ゲルにしてみると改善されそうな気もします。

(無題) 削除/引用 No.1582-19 - 2009/11/18 (水) 16:35:45 - う 別に会社も回し者ではないですが ttp://www.amazon.co.jp/バイオ実験イラストレイテッド%E3%80%885〉タンパクなんてこわくない-目で見る実験ノートシリーズ-西方-敬人/dp/4879621668 １つのものを熟読するとかなりためになります。

(無題) 削除/引用 No.1582-18 - 2009/11/18 (水) 15:45:14 - mom-a >Ｖは500でＭＡＸの値です。 >なぜか泳動が遅いんです。スペーサーのゴムも外し忘れていないのですが。 >１0mAで流して、機械に表示される実際のＶは６０Ｖくらいです。 C.C.（電流一定）で、10mAで流しているということですか？昔のことで覚えていないのですが、20mAくらいで流したような気がするので、2時間かかっても特に遅くはないような気がしてきましたが…。（私の記憶違いでしたら申し訳ありません。マニュアル等でご確認下さい。） あと、2枚一度に流すならアンペア倍にしないと遅くなります。 そういえば、ATTOのHPからマニュアルがダウンロードできたような気がします。

(無題) 削除/引用 No.1582-17 - 2009/11/18 (水) 15:00:48 - taka 一番重いバンド(250kDa)がゲルの中央に来るまでというのは、泳動が長すぎるのではないでしょうか？ （Running gelの中央か、Stacking+Runningの中央かで差はありますが。） 目的のタンパクがrunning gelの中央に見えるくらいで充分かと。 ゲルの濃度とマーカーの分離の関係に関しては、カタログ中の既製ゲルかマーカーのあたりに載ってると思います。

横からすみません 削除/引用 No.1582-16 - 2009/11/18 (水) 14:36:40 - mom-a 目に付いたもので… ＞低分子領域は泳動されないのですね。 in situさんは 「かなり高分子領域を見るためのゲルであり、低分子領域のマーカーは分離しなくてもおかしくないと思います。」 とおっしゃっているのです。「泳動されない」のではありません。 ｃさんも 「7%gelだとゲルの下端付近までBPBの青いラインがくるまで流した時、確かに30KDa〜40KDaくらいがBPBのラインあたりかちょっと上くらいの感じとおもいます。それ以下はおそらくうまく分離できなくてもそれはおかしくないと思います。」 とおっしゃっていますよね。 目的のタンパクの大きさに合った濃度のゲルを用いる必要がありますが、その辺については実験書などでも調べることができると思います。

(無題) 削除/引用 No.1582-15 - 2009/11/18 (水) 14:27:07 - ピペット Ｃ　さん ゲルの濃度を変えて挑戦してみます。 具体例をお聞きできて助かります。マーカーは一番大きいバンドが250kDaで一番小さいのが10KDaです。 250kDaがゲル中央まで泳動されます。ちなみにマーカーは買ったばかりです。−２０度で保存しています。 近くに教えてもらえる人がいれば良いのですが、当研究室にはいないので、先生に頼んで他研究室に出向くことも考えてみます。 おお　さん 確認しましたが、購入したてのアクリルアミドです。 ＳＤＳなしでもできるんですね！初めて知りました。

(無題) 削除/引用 No.1582-14 - 2009/11/18 (水) 14:18:39 - ピペット ぷうたん　さん すみません、0.08の間違いでした。 nanasi さん 市販のものもあるのですね。 少し値がはりますが検討させて頂きます。 それから、7.5％ゲルを想定していて、目的タンパクは100kDaです。 in situ さん 最もクリティカルな意見を頂けたと思います。 低分子領域は泳動されないのですね。 私の研究室では、つい最近ＳＤＳ-Pageを私と先輩の二人で始めたばかりだったので、一同アクリルアミド濃度が低い高分子用のゲルでも低分子領域まできちんと泳動されるものの思っていました。 笑い男　さん 実は、ＳＤＳ−Ｐａｇｅは当研究室でつい最近行われ始めた実験で、器具や試薬も新しかったため、実験者である私の手技が一番に疑われるポイントだったので、ゲルかバッファーを疑いました。 笑い男さんのおっしゃる通り、先生はマーカーがおかしいのではないかとアドバイスくれましたが、そもそもはin situさんの返信に書かせて頂いた通り、私の勉強不足によるものでした。前述の様に、新しい実験なので教えてもらえる人もおらず、私と先輩でタンパクやＳＤＳ-Pageの本を読んだりネットで見たりしていたのですが、情報の集め方もまだまだ初心者でうまくトラブルシューティングできずにここに書き込ませて頂きました。 こうじ　さん ＡＰＳの量が間違っていました。すみません。 ゲルは10cm正方形のもので、Ｒの上にＳをのせています。 Ｖは500でＭＡＸの値です。 なぜか泳動が遅いんです。スペーサーのゴムも外し忘れていないのですが。 １0mAで流して、機械に表示される実際のＶは６０Ｖくらいです。 mouikkaiさん 私も泳動時間が遅いと感じています。しかし、バンドがなかなか動いてくれず、結局２Ｈくらいかかっていまいます。

(無題) 削除/引用 No.1582-13 - 2009/11/18 (水) 04:21:12 - おお ああSDS確かにおおいいなぁ。。。 0.1%だよファイナルコンセントレーション。 なくてもきれいに流れるのでゲルをSDSフリーにする のもトレンドのようです。 実際私もSDSを入れなくなりましたが、殆どもんだいありません。

(無題) 削除/引用 No.1582-12 - 2009/11/18 (水) 04:05:51 - おお bis-acrylamideがはいってなかったりして。。。。。。

(無題) 削除/引用 No.1582-11 - 2009/11/17 (火) 22:33:52 - c 7%gelだとゲルの下端付近までBPBの青いラインがくるまで流した時、確かに30KDa〜40KDaくらいがBPBのラインあたりかちょっと上くらいの感じとおもいます。それ以下はおそらくうまく分離できなくてもそれはおかしくないと思います。ただそれでも200KDaマーカーはすくなくとも真ん中よりは上の方にとどまっている感じです。使用している分子量マーカーの一番大きいもの（真ん中あたりにくるといっているマーカー）の分子量はいくつか、また調べたい蛋白質の分子量（使用する分離ゲル濃度は通常これに基づいて選択します。）はどのくらいか、教えてもらえたらと思います。 近くにSDS-PAGEをやっていてうまくいっている人がいるならば、見学させてもらって、よくメモをとりながら自分のやり方と違うところがどこか考えるのが一番いいと思います。そのとき調べたい蛋白質の分子量、実験目的、うまくいかないときのゲル濃度の３点は協力者に伝えて意見を仰ぎましょう。あれこれ悩むより実際の様子をその場で質問しながら目の前で見るほうが解決もずっとはやいです。今のやり方を紙に書いて、SDS-PAGEに慣れている人に見てもらうのもいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.1582-10 - 2009/11/17 (火) 22:16:09 - mouikkai >一番重いマーカーのバンドがゲルの中央まで泳動されて、小〜中の分子量のバンドがゲルの下の方で団子状に固まってしまいます >500V20mA2h >500v10mA2h ミニゲルにしては、時間掛けすぎな気がしますがどうでしょうか？泳動時間はSで30min、Rで1Hで十分かと思いますよ。 あと、手元の資料によるとRが7.5%の場合、37kDaのマーカーがやっと底の方に見えるって感じなんですが、ゲルの硬さとマーカーの相性は如何でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1582-9 - 2009/11/17 (火) 22:03:18 - こうじ 10% SDSが0.8mLなのに合計9.5mL強ですよね。 終濃度0.1%SDSになるのが普通なのでレシピ間違ってそうですね。 高分子用のマーカーでない限り、 書かれている挙動はゲル濃度からすると あっている気がしますのでマーカーは問題ないかもしれませんね。 あと、どっちが上でどっちが下にしています？ Rを下にいれてからSを上につくっています？ 書かれ方から逆につんでいる不安もあります。 電圧、電流はパワーサプライの設定上限ですよね。 ゲルの長さにもよりますがかなり時間がかかっている気もします。 （縦に細長いスラブゲルではなく正方形に近いゲルですよね？）

いやらしいコメントするけどね 削除/引用 No.1582-8 - 2009/11/17 (火) 21:14:56 - 笑い男 >[Re:1] ピペットさんは書きました : > マーカーがきちんと泳動されていないということは、ゲルかバッファーに問題があるのかと考えているのですが、どんな問題が予想されるでしょうか？ 　マーカーが壊れている（マーカーと思って使っているものが実はマーカーではなかった）という可能性はありませんか？ 　500V20mA2h/500V10mA2hで本当に大丈夫ですか？ 　電源の装置が壊れていませんか？ 　ゲルかバッファーに問題があると考えた理由はなんですか？ > 先生や先輩に聞いても解決しませんでした。 　先生や先輩には何と質問したんですか？そしてそれに対するコメントはどのようなものでしたか？ 　先生や先輩のコメントの真意はどこにあると考えましたか？ 　あなたはこの問題を解決するためにどのようなアクションを起こしましたか（ここで質問したは無しよ！）？

(無題) 削除/引用 No.1582-7 - 2009/11/17 (火) 20:52:32 - in situ 記載の量に間違いがなければseparating gelのアクリルアミド濃度が約7%になっていますが、作りたいものはそれで間違いないですか？ だとすると、かなり高分子領域を見るためのゲルであり、低分子領域のマーカーは分離しなくてもおかしくないと思います。

(無題) 削除/引用 No.1582-6 - 2009/11/17 (火) 20:44:31 - nanasi 計算するのややこしいので教えてください。 ・何パーセントゲルを想定して作ってますか？ ・目的タンパクは〜KDaを想定しているのですか？

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