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(無題) 削除/引用 No.1565-12 - 2009/11/19 (木) 05:21:02 - おお DMSOがなにかしているかもしれないということですよね。 DMSOの細胞に対する活性については私が昔に 聞いた話ではよく分かっていないが、何らかの反応が あることがあり、分化誘導などでもしばし使われます(結構高い濃度 のことが多いですけど)。 細胞膜の状態を変えたりするようでそれがシグナルとして伝わって いくのではという推測はあるようです。 ICAMですよね。膜タンパクなので膜の生理的機能を妨げている 可能せいは疑おうとおもえば、、、、ってところでしょうか。 DMSOは薬剤添加のためにと言う事でしょうか? それなら思い切って何か違う溶媒にしてみるとかできないでしょうか? DMSOいれる操作に対するモック処理はしてますよね。 あと糖修飾されているタンパクは場合によってはシャープに出ません。 おっぽのついてない火の玉みたいになることとかあります。 砂時計様のばんどは、なんか糖修飾されているタンパクの一部の ポピュレーションだけがその抗体で認識されたのかなぁって 漠然と思ってます。

(無題) 削除/引用 No.1565-11 - 2009/11/17 (火) 16:57:10 - c 細胞生物学等はまだ勉強中で半分素人なのですが、最近、多少お役に立てるかもしれない経験をしたので書きます。 このまえDMSOに試薬溶かして細胞に入れて生化学的な実験をしたのですが、コントロールのDMSOだけのやつでもちょっと面白い変化があり、一方、全く何も加えていないものはその変化ががなくて、これはDMSOが怪しいかなと思い少し勉強したとき下記のような論文を読みました。分化の誘導とかは学校で習ったので知っていたのですが、エピジェネティクな遺伝子発現制御などとの関連でまだいろいろ調べる余地があるかもしれないと思って、素人なりにですがひなときにすこしづつ実験しています。 そうしたことから、見つけておられるウェスタンでのDMSOの濃度依存的な発現の変化は、意味がある重要なオブザベーションの可能性もあると思い、どうもおかしいと悩むよりむしろポジティブにとらえて大事にされたほうがよいと思いました。私が勉強した文献を挙げておきます。今後のご研究のお役に立てれば幸いです。 Discovery and developement of SAHA as an aticancer agent. Marks PA, Oncogene 2007, 26, 1351-1356 Dimethyl sulfoxide to vorinostat: developement of histone deacetylase inhibitor as an aticancer drug. Marks PA et al. Nature Biotech. 2007 84-90

(無題) 削除/引用 No.1565-10 - 2009/11/17 (火) 14:13:42 - つつ ご無沙汰しておりました。 前回の実験で間違いがあったことが発覚しました。 前回の実験ではSDS入りのブロッティングバッファを用いておりましたが、ICAM1はSDSフリーのブロッティングバッファでないとうまくメンブレンに転写されないようでした。 そのため、今回はSDSフリーのブロッティングバッファを用いて転写を行ったところ、前回と違ってバンドが濃く出ました。 それと、サンタクルズの抗体を用いていたことも原因であることが分かりました。 サンタクルズの抗体を用いてICAM1の発現を確認する場合、タンパク量が少ない状態であると砂時計型になるのは仕方の無いことのようです。 ただ、DMSOで前処理したサンプルのバンドが相変わらず薄いことが気になりました。 しかも、DMSOの濃度が濃くなるにつれてバンドが薄くなっております。 DMSOは細胞毒性を考えて0.2％以下になるようにしており、PCRで確認したときはDMSOの濃度に依存しないでICAM1が高発現しておりました。 DMSOはTNFを入れる前の30分間前処理し、TNFを入れた後もDMSOを取り除かないでTNFと一緒に24時間処理しました。（PCRのときはDMSOはTNFを入れる前の30分間前処理し、TNFを入れた後もDMSOを取り除かないでTNFと一緒に90分間処理しました） DMSOを24時間も処理したことで細胞に障害が出たのでしょうか？ 再びのご回答宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1565-9 - 2009/11/15 (日) 17:08:59 - つつ ご回答ありがとうございます。 一度、アミドブラックもCBBもやってみたいと思います。アミドブラックはしばらくやっていなかったので微妙に緊張しますが、確認したいと思います。 また、結果が出次第、ご連絡致します。

(無題) 削除/引用 No.1565-8 - 2009/11/15 (日) 15:15:24 - おお >[Re:7] つつさんは書きました : > 再びのご回答ありがとうございます。 > > マーカーはきれいに流れていました。 > なるほど、アミドブラックで確認すれば目的のタンパクがメンブレンに存在するか分かりますね。 > アミドブラックで確認はしておりませんでした。 > アミドブラックは持っていないのですが、自分で調製できるものでしょうか。 アミドブラックの粉末があればできます。組成はぐぐったらでてくるとおもいますよ。 ニトロセルロースならponceau sの方がいいかもしれません。 あとPVDFならCBBでもそめれるはずですが、、、 CBBをゲルで染色ですか、、、やった方がいいのは確かです。 １度現在の自分のシステムでどのように流れているか把握してなければ 把握した方がいいですし、トラブルがあったと感じているなら いつものように流れているか見ておく方がベターですよね。 あとブロッティングしたあとのげるもCBBで染めてみるのも 診断に役立つかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1565-7 - 2009/11/15 (日) 10:59:51 - つつ 再びのご回答ありがとうございます。 マーカーはきれいに流れていました。 なるほど、アミドブラックで確認すれば目的のタンパクがメンブレンに存在するか分かりますね。 アミドブラックで確認はしておりませんでした。 アミドブラックは持っていないのですが、自分で調製できるものでしょうか。 それともゲルの段階でCBB染色とかをやって確認した方がいいのでしょうか？ 宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1565-6 - 2009/11/15 (日) 04:25:44 - おお >[Re:5] つつさんは書きました : > > ＞おおさん > > 確かにテーリングしていたかもしれません。今後要注意します。 > > しかし、バンドが全く出ていない(DMSOで前処理した方)のは何故でしょうか？ > > 引き続きご回答お願いします。 >[Re:4] おおさんは書きました : > バンドの両端が太くなって真ん中へんはバンドが細いって > ことはたまにありますね。そういう時は端の方は若干てーリング > しているような感じだと思います。 すべての状況について把握してから答えてなかったので、、、 もう少しお時間ください。 てーリングの件はそのた、サンプルの塩濃度、サンプルの量 エイどうの電圧(速さ)、その時のゲルの温度などで左右されると思います。 マーカーはきれいに流れているでしょうか? それとトランスファー後、タンパクをアミドブラックなどで染めているでしょうか? トランスファー後の確認はしないひとも多いと思いますが、 自分で系が樹立できたと思えるまでは少なくとも 見てた方がいいです。私はたいていチェックするようにしています。

(無題) 削除/引用 No.1565-5 - 2009/11/14 (土) 14:08:25 - つつ 早速のご回答ありがとうございます。 ＞ねうろんさん そうですかー、全く同じですね。ゲルが原因だったのですか。ゲルは濃い方を新しいTEMEDで作成し、薄い方を古いTEMEDで作成しました。 同じTEMEDで作成すれば良かったかも知れません。古いのと新しいのだと固まるのに相当差がありましたので。 ＞おおさん 確かにテーリングしていたかもしれません。今後要注意します。 しかし、バンドが全く出ていない(DMSOで前処理した方)のは何故でしょうか？ 引き続きご回答お願いします。

(無題) 削除/引用 No.1565-4 - 2009/11/14 (土) 13:34:14 - おお バンドの両端が太くなって真ん中へんはバンドが細いって ことはたまにありますね。そういう時は端の方は若干てーリング しているような感じだと思います。 グリセロールとか特に濃いいとサンプル両端によっていくんですよね あプライしてから、エイどうをONにする間に。 あとは局所的にトランスファーが乱れたかなぁ、、、、

(無題) 削除/引用 No.1565-3 - 2009/11/14 (土) 13:28:27 - ねうろん >[Re:1] つつさんは書きました : > また、すべてのサンプルが砂時計型のバンドになったわけではなく、サンプルの中にはDMSOで前処理したものもあったのですが（このサンプルも予定では丸く濃いバンドが出るはずでした）、こちらは何もバンドが出ておりませんでした。 今扱っているタンパク質が似た様なバンドを示します。何らかの刺激有無であろうと、組織から細胞からこってこようと。 あれですよね、バンドの端が濃くて、真ん中が薄い感じの。 他の似た様な分子量のタンパク質がノーマルなのにもかかわらず。 私の場合、抗体の希釈率、インキュベート時間をいじりましたが効果は有りませんでした。 一番効いたのは、SDS-PAGEのゲル濃度（濃いのから薄いのへ）でしたけど、ただ単に目立たなくなっただけな気がします。 タンパク質量を多めに流す事でも多少改善しましたが、結局バンドがsaturateしていただけなのかな？と言う気もします。 私も他の方の経験、解決策を参考にしたいです。

(無題) 削除/引用 No.1565-2 - 2009/11/14 (土) 13:12:10 - ；； 細胞の状態が問題なのではなく、泳動の条件、サンプルの塩濃度とかタンパク量とか 電気系の問題だと思います。

ウエスタンで変なバンドが出てきました。 削除/引用 No.1565-1 - 2009/11/14 (土) 13:04:36 - つつ 先日、ウエスタンブロットを行っていたのですが、砂時計を横にしたようなバンドが出てきました。 確認したいタンパクは細胞表面に発現するICAM1なのですが、このタンパクはTNFaによって刺激を受けて高発現します。 実験をしていて気になる点といえば、電気泳動をするためにサンプルを得ようと、細胞にTNFaを添加して一晩培養してみた時に細胞が若干剥がれていたことです。 そのときに差ほどの支障が無いと思い、ホモジネートして電気泳動を行ったことが原因でしょうか？ しかし、その場合はネガティブコントロールであるアクチンにも影響が出るはずなのですが、そちらはきれいにバンドが出ておりました。もちろん、サンプルもアクチンも同じ細胞で実験しました。 それとも、一晩かけて処理したTNFaによって細胞表面のタンパクは剥がれるが、コントロールであるアクチンは無事であったというようなことが起こったのでしょうか？ また、すべてのサンプルが砂時計型のバンドになったわけではなく、サンプルの中にはDMSOで前処理したものもあったのですが（このサンプルも予定では丸く濃いバンドが出るはずでした）、こちらは何もバンドが出ておりませんでした。 もちろん、DMSOで前処理したサンプルもコントロールであるアクチンも同じ細胞を用いています。 宜しくお願いします。

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